伯森生技電子報 20194月號第3 無法看到畫面顯示?請點選這裡開啟網頁 友善列印
WB 結果與目標蛋白預測位置不同?請先檢查這 5 點

Western Blot ( WB ) 是生科領域研究人員最常進行的分析實驗,但這樣一個普遍、簡易的研究方法,卻常會出現各種稀奇古怪的問題。

當我們進行 WB 分析目標蛋白時……

 

Band 的位置與預期不同? 請先檢查這 5 點!

面對這種實驗結果,該如何判定問題出在哪裡? Abcam 提供您以下五條分析準則:

(1) 內源性蛋白 or 重組蛋白
追本溯源,先檢查樣本是內源性蛋白還是重組蛋白?若是重組蛋白,就要看它是否為全長序列 ( full-length )。若非全長,則 band size 自然會與目標蛋白的預測位置不同。

(2) 是否有其他 Isoform
若樣本為內源性蛋白,那研究者們務必去看它有沒有其他 Isoform?可以透過 Abcam 產品網頁 Datasheet 分頁裡的 "Target" 標籤,快速找尋到 Database links 資訊,裡面有該蛋白的 SwissProt 網頁連結,可直接點擊前往查詢。

(3) 是否有剪切活化
若在 SwissProt 資料庫或是文獻中提到蛋白需要剪切活化,則結果自然會與目標蛋白的預測位置不同。

(4) 是否為 Dimer 或 Polymer
如果 WB 的結果與目標蛋白的預測大小有倍數關係,則有可能這個蛋白是 Dimer 或 Polymer 。

(5) 蛋白是否有修飾
除上述 4 種原因,預測值與實驗結果不同,也很可能是蛋白有受到轉譯後修飾,例如常見的:Phosphorylation, Acetylation, N-linked glycosylation, Amidation, Hydroxylation, Methylation, O-linked glycosylation, Ubiquitylation, Sulfation 等。
不同狀態下的蛋白質會有不同的修飾,加入官能基後,蛋白的分子量一定會比預測值大。Glycosylation 是較為常見的修飾,它會使蛋白質的分子量上升。

我們可以將以上敘述,簡化為下方圖表。下次再遇到 WB band 與目標蛋白的預測位置不同時,您就可以參照圖表迅速想起這五個提示:

  • 確認樣本是內源性蛋白或重組蛋白;若是重組蛋白,確認是否為全長序列。
  • 善用 SwissProt 資料庫,看目標蛋白是否有其他 Isoform 。
  • 確認 SwissProt 資料庫與文獻是否有提及剪切活化,造成分子量變小。
  • 確認樣本蛋白是否為 Dimer 或 Polymer 。
  • 使用 SwissProt 或其他資料庫(如 NCBI)查詢蛋白是否有轉譯後修飾,造成分子量上升。

以上就是 Abcam 提供的五條分析準則,若是仍沒找到問題,就要回頭檢視是否為實驗流程出錯了。

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