伯森生技電子報 20199月號第4 無法看到畫面顯示?請點選這裡開啟網頁

挑戰 Alzheimer,Alpha 一直都在

每 3 秒發生一例

阿茲海默症 (Alzheimer's disease, AD) 俗稱老年癡呆症,是神經退化性疾病「失智症」的一種,確切病因迄今仍未完全闡明。阿茲海默症患者將會越來越需要照護,並具有冗長的病程,無論是對病人本身、家庭和社會,都帶來沉重的負擔。

失智症是一個人類全球性、愈演愈烈的問題,從 2014 年全球每 4 秒一例失智症患者,直線攀升至 2018 年的每 3 秒 1 例。2018 年全球約有 5 億人患有失智症,到 2050 年,將增至 15.2 億。隨著罹患人口的增加,伴隨而來的將是社會成本的急遽上升。2018 年全球社會失智症相關成本為 1 萬億美元,至 2030 年,這一數字將增至 2 萬億美元。

這樣一個幾乎關乎每個人生活質量和逐年上升的龐大醫藥市場領域,在近四十年吸引了科學家們、製藥產業、以及政府投入大量的財力和精力,然而對此疾病的發病機制、診斷、治療和預防等方面,卻仍一直舉步維艱,成效甚微。

挑戰 Alzheimer

阿茲海默症的典型病理特徵是患者腦部組織中會出現類澱粉蛋白斑塊 (Amyloid plaques) 及神經纖維糾結 (Neurofibrillary tangles) 的現象。目前科學家們對於阿茲海默症的發病機制,普遍認為是由大腦中的兩種蛋白質參與其中,一種是 Aβ (β-Amyloid),會在患者腦部神經元間異常大量堆疊聚集形成斑塊,破壞神經細胞功能;另一種蛋白叫做 Tau,同樣會在患者腦部大量表現,並在神經元內形成神經纖維糾結,從而阻斷神經元的傳輸。一直以來,針對阿茲海默症的研究靶點與藥物開發重點也聚焦在這兩者之中。

Aβ 是由類澱粉前驅蛋白 (Amyloid precursor protein, APP) 經過酵素切割水解而成的一段胜肽,其代謝途徑如下:

Figure 1. APP metabolites. APP protein (695 amino acids) is processed via two alternative pathways, resulting in cleavage by α secretase to generate sAPPα or β secretase to generate sAPPβ. Following cleavage by β secretase, additional cleavage by γ secretase releases the Aβ peptide and the intracellular domain (AICD) detaches from the cytofacial leaflet. IMAGE © J Neurochem. 2012 Jan;120 Suppl 1:99-108, Figure 1.

APP 類澱粉前驅蛋白分別經由 α、β 分泌酶 (secretase) 切割生成 sAPPα 與 sAPPβ。研究顯示,sAPPα 具有神經營養與保護作用,sAPPβ 則會產生神經毒性,使細胞凋亡引起發炎反應。γ 分泌酶是一種膜蛋白酶,可以直接或間接地產生各種序列長度的 Aβ 胜肽。腦脊髓液中的 Aβ 主要從 Aβ1-13 到 Aβ1-42,其中以 Aβ1-40 最多。透過抑制 γ 分泌酶的活性,可以抑制 Aβ 胜肽的產生 [1]。

早在 2012 年,Gunnar Brinkmalm 就使用 AlphaLISA 高通量免疫分析方法驗證了 43 個臨床病人腦脊髓液樣品中的 sAPPα 與 sAPPβ 含量變化,並探討其作為臨床診斷生物指標的可能性 [2]。

Figure 2. Scatter plots showing CSF levels of sAPPα and sAPPβ. The levels of sAPPα and sAPPβ are measured by the AlphaLISA assay (a,c) from control individuals (n = 44) and subjects with AD (n = 43). IMAGE © J Neurochem. 2012 Jan;120 Suppl 1:99-108, Figure 3a and 3c.

Erik Portelius 則使用 AlphaLISA 定量測定腦脊髓液中 Aβ1-15/16 的濃度,作為篩選 γ 分泌酶抑制藥物的指標物 [3]。

除了直接在臨床樣本中測定指標物,Ting-Hai Xu 建立了 HTL 細胞體外篩選體系,以篩選 γ 分泌酶對突變 APP 的結合和切割位置,並使用 AlphaLISA 檢測 Aβ42 和 Aβ40 表現量變化情況。接著進一步使用 Notch 受體 "Notch 1" 測試此篩選模式對 APP 以外的 γ 分泌酶反應受質的辨識度,探討其作為 γ 分泌酶反應受質通用篩選系統的可能性 [4]。

中國著名學者施一公的研究團隊則恰好使用了相反的研究策略,透過架構的 HEK293 細胞體外表達系統,取得 138 種帶有 Presenilin-1 (PS1) 突變的 γ 分泌酶突變體,並使用 AlphaLISA 檢測 Aβ42/Aβ40 比例變化,以探討 PS1 突變對於 γ 分泌酶生成 Aβ42 和 Aβ40 的影響性 [5]。

Figure 3. Preliminary analysis of 10 AD-derived PS1 mutations. (A) A schematic diagram of the major workflow in this study. The WT human γ-secretase and 138 variants, each containing an AD-derived mutation in PS1, were individually overexpressed and purified. The peak fractions were incubated with APP-C99 and examined for the production of Aβ42 and Aβ40 using the AlphaLISA assay. (C) Effect of 10 AD-derived PS1 mutations on the generation of Aβ42 and Aβ40. IMAGE © Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Jan 24;114(4):E476-E485, Figure 1A and 1C.

De-ming Chau 則使用生物素 (Biotin) 標定的 Notch 1 作為 γ 分泌酶反應受質,結合 AlphaLISA 檢測技術,開發了針對 Notch 訊息傳導路徑的 γ 分泌酶抑制劑高通量篩選系統。

此系統可在 1536 孔的微量多孔盤進行反應,具有重複性高、成本低、高度自動化等特性,極適合需要快速大量進行精確檢測的藥物篩選實驗 [6]。

隨著近幾年來 Aβ 標靶抗體藥物及相關抑制劑藥物的開發失敗,也驅使人們加強了對 Tau 蛋白磷酸化、聚集、解聚的研究,並將其視為治療阿茲海默症的新切入點。

X. Medda 在 2016 年的研究中,創新性地開發出可用於高重複性 Tau 聚集實驗分析和體外藥物篩選的人類 iPS 來源皮層神經細胞分析系統。此系統採用稀釋的 Matrigel 來形成三維薄層培養基,於 384 孔的微量多孔盤中培養,可維持五週以上的健康細胞。作者同樣選擇使用 AlphaLISA 技術來進行 Tau 蛋白聚集檢測 [7]。

深受信賴的 Alpha 檢測技術

Alpha 檢測技術之所以能被廣泛採用,重點在於其背景乾淨、高訊噪比、免沖洗流程、抗干擾能力強等檢測特點,在體外活性檢測、脂質體活性檢測和細胞活性檢測三種模式中,都顯示出傳統檢測方式無法媲美的卓越性能。

Figure 4. Alpha protein:protein interaction assay.

我們可將 AlphaLISA 簡化描述為「只需混合無需洗滌的 ELISA」,又因其供體微珠 (Donor bead) 和受體微珠 (Acceptor bead) 之間的信號傳遞有效距離可達 200 nm,比其他均相檢測方式,如 TR-FRET(能量傳遞距離 ~10 nm),更適合生物大分子間的親和力結合實驗。再加上 AlphaLISA 檢測反應可縮小至 5 μl 的微量體積,以及以近紅外線雷射光激發、促發化學冷光訊號的檢測方法,相較於傳統的 ELISA 技術,更適合高通量、高靈敏度樣品的檢測和篩選。

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References

  1. Functions of Aβ, sAPPα and sAPPβ : similarities and differences. J Neurochem. 2012 Jan;120 Suppl 1:99-108. PMID: 22150401
  2. Soluble amyloid precursor protein α and β in CSF in Alzheimer's disease. Brain Res. 2013 Jun 4;1513:117-26. PMID: 23541617
  3. Amyloid-β(1-15/16) as a marker for γ-secretase inhibition in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 2012;31(2):335-41. PMID: 22531418
  4. Alzheimer's disease-associated mutations increase amyloid precursor protein resistance to γ-secretase cleavage and the Aβ42/Aβ40 ratio. Cell Discov. 2016 Aug 23;2:16026. PMID: 27625790
  5. Analysis of 138 pathogenic mutations in presenilin-1 on the in vitro production of Aβ42 and Aβ40 peptides by γ-secretase. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Jan 24;114(4):E476-E485. PMID: 27930341
  6. A novel high throughput 1536-well Notch1 γ -secretase AlphaLISA assay. Comb Chem High Throughput Screen. 2013 Jul;16(6):415-24. PMID: 23448293
  7. Development of a Scalable, High-Throughput-Compatible Assay to Detect Tau Aggregates Using iPSC-Derived Cortical Neurons Maintained in a Three-Dimensional Culture Format. J Biomol Screen. 2016 Sep;21(8):804-15. PMID: 26984927
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