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文獻選讀: CDK4/6 , 癌症治療新可能!

摘要 —— 2017 年 6 月,Piotr Sicinski 教授研究團隊在 Nature 雜誌中闡述了細胞週期素 (Cyclin) D3-CDK6 激酶在腫瘤細胞存活中所具有的代謝功能。

Cyclin D1, D2, D3 和相關激酶 CDK4/6 是調控細胞增殖的重要基因,抑制 CDK4/6 可以造成細胞週期的停滯。Piotr Sicinski 教授研究團隊發現,在某些腫瘤中抑制 Cyclin D 及 CDK4/6 還可以引起細胞凋亡,造成腫瘤消退。

在 Cyclin D3-CDK6 複合物高度表現的癌細胞中抑制 CDK4/6,可以減少複合物對糖解作用的抑制,從而防止碳流進入五碳醣磷酸途徑 (PPP) 和 Serine 合成通路,減少抗氧化的 NADPH 和 Glutathione 合成,使得癌細胞在氧化壓力下出現凋亡。在腫瘤小鼠和其他高度表現 Cyclin D3-CDK6 的癌細胞中使用 CDK4/6 抑製劑,也能起到相同的作用。

這一研究揭示了 CDK4/6 在癌症中除了促進細胞增殖,還有改變癌細胞代謝的作用,使得抑制 CDK4/6 在治療高度表現 Cyclin D3-CDK6 複合物的癌症中成為一項可行的方案。

The metabolic function of cyclin D3–CDK6 kinase in cancer cell survival. Nature. 2017 Jun 15;546(7658):426-430. doi: 10.1038/nature22797.

Cyclin D-CDK4/6 具有促進細胞增殖以外的功能?

D 型細胞週期素 (Cyclin D1/D2/D3) 可以活化細胞週期蛋白依賴性激酶 (CDK4/6),從而促進細胞增殖,這些基因常常在癌細胞中高度表現。抑制這一反應路徑的限速蛋白 RB1 (Retinoblastoma protein),就可以造成 RB1 高表現量的癌細胞細胞週期停滯。

之前的研究發現,在 T 細胞急性白血病 (T-cell acute lymphoblastic leukaemia, T-ALL) 細胞中抑制 Cyclin D3 或 Cyclin D-CDK4/6 複合物,不光可以造成細胞週期的停滯,還可以引起細胞凋亡。令人驚奇的是,在 T-ALL 細胞中,即使是 RB1 表現量低的細胞株也能在 CDK4/6 被抑制的時候出現凋亡,這就暗示了 Cyclin D-CDK4/6 在這類細胞中具有促進細胞增殖以外的功能。

Cyclin D-CDK 作用示意圖

找出關鍵 —— 糖解作用!

從 T-ALL 細胞的相關基因分析發現,T-All 細胞中主要表現的是 Cyclin D3 和 CDK6,細胞中也有很多 Cyclin D3-CDK6 複合物。

為了探究 Cyclin D3-CDK6 複合物抑製劑是如何引起細胞凋亡的,作者透過免疫沉澱來找尋與複合物相互作用的蛋白。通過質譜分離和 Gene Oncology 資料庫比對得知,T-ALL 細胞中只有與糖解作用相關的蛋白是顯著高表現的。

T-ALL 細胞中與 Cyclin D3-CDK6 結合的蛋白都與糖代謝相關

糖解過程中一共有 11 個酶,其中 10 個與 Cyclin D3-CDK6 複合物有相互作用。但由於果糖磷酸激酶 (PFK1) 和 M2 型丙酮酸激酶 (PKM2) 是糖解中的限速酶,且催化的是過程中的兩個不可逆反應,因此作者將目光聚焦在這兩種酶上。

讓我們一起來複習一下糖解作用:

糖解作用(紅色方框中是本文研究的酶)

作者驗證了在試驗的 5 株細胞中,Cyclin D3-CDK6 複合物都與 PFK1 和 PKM2 具有相互作用。他們還利用質譜確定了這兩種蛋白的磷酸化作用位置。

PFK1 的三種亞型 (PFKP 、PFKL 和 PFKM) 與 PKM2 的磷酸化作用位置,其中 PFKM 無法區分磷酸化是位於 S667 或 T669

體外實驗還證明,PFK1 的三種亞型 (PFKP/PFKL/PFKM) 以及 PKM2 都可以被 Cyclin D3-CDK6 複合物磷酸化而降低活性,且這一過程可以被 CDK4/6 的抑製劑 Palbociclib 或 Cyclin D3 與 CDK6 的專一性 shRNA 所抑制。

PFK1 和 PKM2 這兩種蛋白都經常以二聚體的形式存在,並在形成四聚體時表現出更高的活性。而 Cyclin D3-CDK6 複合物對它們的磷酸化,則阻止了二聚體到四聚體的轉變,從而抑制了它們的活性。當 PFK1 和 PKM2 活性被抑制後,醣類代謝的糖解作用速率降低,碳流則轉向進入 PPP 途徑和 Serine 合成途徑。

氧化壓力扭轉癌細胞命運

碳流進入 PPP 途徑會生成 NADPH,Serine 合成途徑會合成 Glutathione (GSH)。NADPH 和 GSH 是細胞內抗氧化的主要成分,這兩種物質的增加就暗示著癌細胞抗氧化壓力的能力提高,癌細胞更難被殺死。

而利用 Palbociclib 處理 T-ALL 細胞確實可以引起細胞凋亡,細胞內活性氧 (Reactive oxygen species, ROS) 含量也確實升高了。如果在 Palbociclib 處理的同時加入抗氧化劑 N-acetyl-cysteine (NAC) 或超氧歧化物酶擬似物 MnTMPyP,則可以降低細胞內 ROS 含量,並使得細胞凋亡率回到對照組水平。

作者還使用模擬磷酸化突變的 PFK1 和 PKM2 進行實驗,這兩種蛋白突變體會一直處在類似被磷酸化的狀態。Palbociclib 處理後,細胞內的 PFK1 和 PKM2 活性並沒有增高,進入 PPP 途徑和 Serine 合成途徑產生的 NADPH 和 GSH 也沒有減少,細胞氧化壓力沒有增高,細胞凋亡率也沒有上升。但由於 CDK4/6 被抑制,細胞確實出現了細胞週期的停滯。

而在細胞中表達磷酸化抑制突變的 PFK1 和 PKM2,則使細胞表現出被 Palbociclib 處理後的反應 —— 細胞的 PFK1 和 PKM2 活性提高,NADPH 和 GSH 產量減少,細胞氧化壓力提高,細胞凋亡率上升。

作者將 T-ALL 細胞接種到小鼠中,並用 Palbociclib 處理後觀察到了相同的結果 —— Palbociclib 可以抑制 T-ALL 細胞增殖並造成腫瘤的消退。但如果接種的是具有模擬磷酸化突變的 PFK1 和 PKM2 的 T-ALL 細胞,Palbociclib 就失去了它的治療效果。

抑制  Cyclin D3-CDK6 複合物,導致細胞凋亡的機制圖

不止是 T-ALL 細胞

作者還對其他癌細胞進行了實驗。在 10 株乳腺癌細胞中,使用 Palbociclib 抑制 CDK4/6 可以引起細胞週期的停滯,有時會出現細胞衰老,但並不會出現細胞凋亡。因為乳腺癌細胞主要是高度表現 Cyclin D1-CDK4 複合物,其對 PFK1 和 PKM2 的磷酸化作用並不強。但如果聯合使用 Palbociclib 和 PPP 途徑的抑製劑,即可得到較好的治療效果。

作者又從癌細胞株百科全書 (Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE) 中選取了 20 株高度表現 Cyclin D3 和 CDK6 的細胞株,經驗證其中 18 株的確是高度表現 Cyclin D3 和 CDK6,Palbociclib 可使其中 16 株發生細胞凋亡。而選取的 10 株 Cyclin D3、CDK6 低表現量的細胞株,在 Palbociclib 處理後無一出現凋亡。

作者還將臨床收集到的 33 例黑色素瘤接種到小鼠中,靜脈注射另一種 CDK4/6 抑製劑 Ribociclib 可以抑制大部分黑色素瘤的增殖,而其中高度表現 Cyclin D3-CDK6 的三例則出現了長期消退!

作者的研究成果揭示了 Cyclin D 和 CDK4/6 不僅在癌細胞增殖中起到了作用,還在癌細胞代謝裡具有實質的影響性。在 Cyclin D3-CDK6 高表現的癌症中抑制 CDK4/6,除了可以抑制癌細胞增殖,還可以改變癌細胞代謝從而提高細胞氧化壓力進而直接造成癌細胞凋亡,這為未來的癌症篩選以及治療提供了一條新思路。

讓 Abcam 感到驕傲的是,Abcam 也在這項新的研究發現中出了自己的一份力。文中引用 Apoptosis Inducer kit、以及 Cyclin D1–CDK4, Cyclin D3–CDK4, Cyclin D3, PFKP, PFKL, PSAT1, Phosphoserine-Proline/Phosphothreonine-Proline 等多款蛋白質與抗體。詳細產品資訊,歡迎洽詢 Abcam 台灣代理 — 伯森生技。

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