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輕鬆解決各種激酶活性檢測難題 — 以建立 Raf1 激酶抑制劑藥物篩選平台為例

輕鬆解決各種激酶活性檢測難題
以建立 Raf1 激酶抑制劑藥物篩選平台為例

激酶功能異常涉及多種人類疾病,如癌症、心血管疾病、自體免疫疾病、發炎性疾病、神經系統疾病等,因此在過去 20 年期間,蛋白激酶家族一直是藥物研發領域的研究熱點。根據統計,全球約有 20-33% 的研發能量正投入於激酶藥物開發,截至 2020 年 1 月 1 日止,已有 52 種激酶小分子抑制劑藥物取得美國食品藥物管理局 (FDA) 核准,並有 175 種口服激酶抑制劑藥物進入臨床測試階段 [1]。

激酶藥物篩選方式與策略

以現行採用的激酶藥物篩選方式來說,儘管基於細胞模式的檢測方式 (Cell-based assay),更能模擬藥物於生物體內的狀態,而有使用率增加的趨勢,無細胞參與的生化檢測方式 (Biochemical assay) 仍受惠於實施簡便成本較低等優勢,成為早期藥物篩選的主流手段。

在進行激酶抑制劑藥物篩選實驗時,主要有兩種篩選策略,一種是測定所形成的磷酸化受質 (Phosphorylated substrate) 含量,此種方式通常需要使用到磷酸化受質的專一性抗體,因此科研人員可能會面臨到抗體價格高昂或無現成抗體可用等問題;除此之外,為確保抗體能夠充分地與磷酸化受質結合,往往需要一段較長的抗體反應時間,導致篩選時程拉長、延緩篩選效率。

另一種較為快捷與通用的篩選策略,是測定激酶磷酸化反應中消耗的 ATP 含量。新藥開發技術領導品牌 PerkinElmer 所設計推出的easylite-Kinase™ 檢測試劑即是利用「螢光素酶 (Luciferase)」在受質「螢光素 (Luciferin)」與 ATP 存在時,可反應產生冷光的特性,來協助科研人員快速檢測激酶磷酸化反應後殘餘的 ATP 含量。使用時,僅需在激酶磷酸化反應中加入等體積的 easylite-Kinase™ 檢測試劑,混合製備 1-2 分鐘(此時 easylite-Kinase™ 試劑會終止激酶磷酸化反應,並與反應中剩餘的 ATP 作用產生光),最終以盤式冷光儀讀取訊號。當反應中含有有效的抑制劑藥物時,由於激酶活性受到抑制、剩餘的 ATP 含量增加,光訊號讀值也就會隨之增加。

easylite-Kinase™ scheme. (A) The initial kinase reaction (composed of the kinase, kinase substrate, and ATP) is run, depleting ATP. easylite-Kinase reagent is added to the kinase reaction to produce a luminescence signal proportional to the amount of ATP remaining. (B) When the test compound inhibits the kinase, ATP remains available for the luciferase reaction, leading to an increased level of emission of light.

easylite-Kinase™ scheme. (A) The initial kinase reaction (composed of the kinase, kinase substrate, and ATP) is run, depleting ATP. easylite-Kinase reagent is added to the kinase reaction to produce a luminescence signal proportional to the amount of ATP remaining. (B) When the test compound inhibits the kinase, ATP remains available for the luciferase reaction, leading to an increased level of emission of light.

easylite-Kinase™ 檢測試劑可廣泛使用於各種激酶活性分析與篩選實驗,其產品優勢不僅在於簡單的操作步驟(加入-混合-讀取),更體現在其所呈現的最終訊號為冷光型式。冷光訊號的優勢在於可快速簡便地讀取,不需具有專用雷射光源或濾片的偵測設備;且冷光訊號通常可提供高訊噪比,能夠加快檢測速度。easylite-Kinase™ 的另一個優點,即是其所產生的光訊號會與藥物的抑制效力成正比,可避免傳統檢測方式中由於干擾物所導致的偽陽性篩選結果。

以 easylite-Kinase™ 檢測試劑建立 Raf1 激酶抑制劑藥物篩選平台

Raf1 (cRaf-1) 在人體內負責磷酸化 MEK1,啟動 MEK-ERK 路徑。為了確保我們所建立的激酶反應,激酶活性僅來自於 Raf1,選用了不具有激酶活性的 MEK1 (K97M) 突變體作為反應受質。經由激酶、受質與 ATP 濃度滴定測試,我們確定了 Raf1 激酶反應的最佳作用條件為:0.3 μg/mL Raf1、100 μg/mL MEK1 (K97M)、300 nM ATP。將 10 μL 激酶反應試劑置於 384-well AlphaPlate™ 孔洞中(AlphaPlate™ 為淺灰色盤,兼具白盤放大訊號與黑盤避免孔洞間交互干擾的優質特性),於室溫下進行磷酸化反應 20 分鐘,接著加入 10 μL easylite-Kinase™ 檢測試劑,於室溫下混合 2 分鐘後行冷光訊號偵測。

Protocol for Raf1 easylite-Kinase assay.

Protocol for Raf1 easylite-Kinase assay. Kinase reactions were initiated with the addition of ATP and carried out at room temperature using a 10 μL kinase reaction volume in a 384-well AlphaPlate™. To terminate the kinase reaction at the indicated time, easylite-Kinase reagent was added in equal volume (10 μL/well) to the assay plate. The plate was covered, agitated for two minutes on a plate shaker (1100 rpm), and read on the VICTOR® Nivo™ (PerkinElmer) using standard luminescence settings.

我們使用已知的 Raf1 抑制藥物「Sorafenib」來驗證所建立的 Raf1 easylite-Kinase 篩選平台對 Raf1 抑制劑的檢測能力。在加入 ATP 前,先將 0.3 μg/mL Raf1、100 μg/mL MEK1 (K97M) 與不同濃度的 Sorafenib 反應 10 分鐘,接著加入 ATP 啟動磷酸化反應,並依循前述步驟加入 easylite-Kinase™ 試劑進行檢測。實驗結果顯示,Sorafenib 的半抑制濃度 (IC₅₀) 為 8.5 nM,該數值與使用 γ-[33P]ATP 放射性偵測平台所測得的 IC₅₀ 值「6 nM」具有良好的相關性 [2]。

Raf1 inhibition by Sorafenib, IC₅₀ = 8.5 nM.

Raf1 inhibition by Sorafenib, IC₅₀ = 8.5 nM. Raf1 was preincubated with Sorafenib for 10 minutes in the presence of MEK1 K97M substrate before initiating the kinase reaction by the addition of ATP.

除此之外,我們還以實驗證實 Raf1 easylite-Kinase 篩選平台的訊號可穩定維持 2 小時,高通量分析品質 Z 因子 (Z' value) 為 0.76,顯示 easylite-Kinase™ 作為高通量篩選實驗工具的良好適用性與可靠度。完整實驗數據與詳盡報導,可參見原文〈Optimization of a Raf1 Kinase Biochemical Assay Monitoring ATP Depletion Using the easylite-Kinase Luminescence Assay〉。更多激酶活性分析與磷酸化蛋白質偵測實驗解決方案,歡迎洽詢 PerkinElmer 台灣代理 — 伯森生技(線上留言諮詢伯森業務專員聯絡資訊)。

References

  1. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors: A 2020 update. Pharmacol Res. 2020 Feb;152:104609. PMID: 31862477
  2. CBAY 43-9006 exhibits broad spectrum oral antitumor activity and targets the RAF/MEK/ERK pathway and receptor tyrosine kinases involved in tumor progression and angiogenesis. Cancer Res. 2004 Oct 1;64(19):7099-109. PMID: 15466206
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