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[抗體實戰技巧] Ki67, CD31, NLRP3 實驗成功小撇步 | Abcam

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Ki67, CD31, NLRP3 實驗成功小撇步

Ki67、CD31 與 NLRP3 由於蛋白質本身的特性,比較不容易取得理想的檢測結果,因此特別提供以下注意事項,期望能幫助您更快取得成功的實驗結果!完整產品資訊與技術應用支援,歡迎洽詢 Abcam 台灣代理 — 伯森生技。

Ki67

Ki67 最早發現於何杰金氏淋巴瘤 (Hodgkin lymphoma) 的細胞核中,常被用來作為細胞增殖的標誌物。它在細胞增殖活躍期(G1、S、G2 和 M 期)位於細胞核,而在 G0 期無法檢測得到。 由於 Ki67 座落在細胞核中,在進行 IHC-P 與 ICC/IF 檢測時,需特別注意以下事項,以確保理想的實驗結果。

Ki67 的 IHC-P 檢測注意事項

  1. 抗原修復 (antigen retrieval) - 推薦使用 pH6 的 Sodium citrate 緩衝液加熱修復抗原 20~30 分鐘,或使用胰蛋白酶 (trypsin)、蛋白酶 K (proteinase K) 進行抗原修復。
  2. 通透處理 (permeabilization) - 若切片厚度大於 5 μm,推薦使用 0.2% Triton X-100 PBS 對切片進行通透處理(打洞)10 分鐘。

圖 1﹑使用 Recombinant Anti-Ki67 antibody [SP6] (ab16667) 對 FFPE 人類扁桃體組織切片進行染色。切片經過 pH6 Sodium citrate 緩衝液加熱修復抗原 20 分鐘。一級抗體染色條件為:1:200,室溫反應 15 分鐘。

Ki67 的 ICC/IF 檢測注意事項

  1. 固定細胞 (fixation) - 推薦使用 4% Paraformaldehyde (PFA) 於室溫固定細胞 20 分鐘。過度固定會使訊號減弱。
  2. 通透處理 - 推薦使用 0.1% Triton X-100 對細胞進行打洞 5 分鐘。

圖 2﹑在不同抗體稀釋濃度與打洞處理條件下,使用 Recombinant Anti-Ki67 antibody [SP6] (ab16667) 對 HepG2 細胞進行染色。(A) 1:50 一級抗體稀釋濃度;0.1% Triton X-100 打洞處理 5 分鐘。(B) 1:200 一級抗體稀釋濃度;0.1% Triton X-100 打洞處理 5 分鐘。(C) 1:50 一級抗體稀釋濃度;無打洞處理。(D) 1:200 一級抗體稀釋濃度;無打洞處理。

CD31

CD31 是一個 83 kDa 的穿膜蛋白,主要表現於血小板、白血球表面及內皮細胞接合處,參與發炎反應中白血球穿過內皮細胞層的遷移活動 (transendothelial migration, TEM)。以下是 CD31 的 Western Blot、IHC-P 與 ICC/IF 的實驗注意事項。

CD31 的 Western Blot 檢測注意事項

  1. 樣本處理 - 裂解樣本時使用足量的蛋白酶抑制劑 (protease inhibitors),防止蛋白降解。
  2. 蛋白質定量 - 使用 BradfordBCA 等試劑測定樣本的總蛋白量,並在電泳膠片孔槽中注入 20-50 μg 總蛋白,以確保樣本中的 CD31 含量高於 Western Blot 最低檢測極限。
  3. 優化抗體濃度 - 建議測試抗體稀釋濃度,避免背景值過高的問題,以獲得最佳的訊噪比。

圖 3﹑在不同抗體稀釋濃度下,使用 Recombinant Anti-CD31 antibody [EPR17260-254] (ab213175) 檢測小鼠肺裂解物。(1) 1:1000 一級抗體稀釋濃度。(2) 1:5000 一級抗體稀釋濃度。

CD31 的 IHC-P 檢測注意事項

  1. 固定組織 - 根據組織塊大小和類型確定固定時間,一般在 4% PFA 或 10% 中性福馬林 (neutral buffered formalin, NBF) 固定 18~24 小時。
  2. 優化抗體濃度 - 第一次使用抗體時,先依照產品說明書建議濃度使用;再依據此結果優化抗體濃度,以獲得最佳的訊噪比。

圖 4﹑使用 Anti-CD31 antibody [JC/70A] (ab9498) 對 FFPE 人類脾臟組織切片進行染色。切片經過 pH6 Sodium citrate 緩衝液加熱修復抗原 20 分鐘。一級抗體染色條件為:5 µg/ml,,室溫反應 15 分鐘。

CD31 的 ICC/IF 檢測注意事項

  1. 固定細胞 - 使用 4% PFA 於室溫固定細胞 20 分鐘。過度固定會使訊號減弱。
  2. 降低背景值 - 使用 0.3M Glycine 消除游離醛基 (free aldehyde group) 所導致的自體螢光干擾問題。

圖 5﹑使用 Anti-CD31 antibody [P2B1] (ab24590) 對 HUVEC 細胞進行染色。細胞在 4% PFA 固定 10 分鐘,再以 0.1% Triton X-100 打洞 5 分鐘,接著使用含有 1% BSA/10% normal goat serum/0.3M glycine 的 0.1% PBS-Tween 緩衝液作為阻斷液 (blocking buffer),反應 1 小時。一級抗體染色條件為:1 µg/ml,,4°C 反應整晚。

NLRP3

NLRP3 在人體中參與了抵禦微生物的免疫反應。目前已知 NLRP3 的功能獲得型突變 (gain-of-function mutations) 與 Cryopyrin 相關週期性症候群 (cryopyrin-associated periodic syndrome, CAPS) 這種罕見的遺傳性自體發炎疾病相關。NLRP3 也與多種慢性疾病相關,包含關節炎、心血管疾病、糖尿病、 阿茲海默氏症 (Alzheimer's disease) 等。以下是 NLRP3 的 Western Blot 實驗注意事項。

NLRP3 的 Western Blot 檢測注意事項

  1. 樣本處理 - 當 NLRP3 表現量過低時,可嘗試使用 LPS (lipopolysaccharide) 或 PGN (peptidoglycan) 處理細胞,誘使 NLRP3 表現量增加 [1]。並在裂解樣本時使用足量的蛋白酶抑制劑 (protease inhibitors),防止蛋白降解。
  2. 提高轉漬 (transfer) 效率 - NLRP3 分子量為 118 kDa。可在轉漬液中加入終濃度 0.1% SDS 以提高蛋白質轉漬效率。
  3. 優化抗體濃度 - 建議測試抗體稀釋濃度,避免背景值過高的問題,以獲得最佳的訊噪比。

圖 6﹑在不同抗體稀釋濃度下,使用 Recombinant Anti-NLRP3 antibody [EPR23094-1] (ab263899) 檢測 THP-1 細胞裂解物。(1) 1:1000 一級抗體稀釋濃度。(2) 1:5000 一級抗體稀釋濃度。

References

  1. Qiao Y, et al. TLR-induced NF-κB activation regulates NLRP3 expression in murine macrophages. FEBS Lett. 2012 Apr 5;586(7):1022-6. PMID: 22569257
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