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讓 COVID-19 變種病毒株無所遁形 ⌖ HiFi 定序強勢助力美國 CDC 追蹤病毒變異

⌖ 讓 COVID-19 變種病毒株無所遁形

HiFi 定序強勢助力美國 CDC 追蹤病毒變異

自 2019 年底 COVID-19 疫情爆發以來,全球確診人數至今仍不斷持續地攀升 [1];英國變種病毒 (B.1.1.7)、南非變種病毒 (B.1.351)、巴西變種病毒 (P.1) 等新興病毒品系的出現,更為疫情控制與治療藥物及現有疫苗功效帶來威脅與挑戰。在這場人類與病毒的攻防戰中,高效且精確迅速地掌握病毒基因體序列變化就變得非常重要。

目前美國疾病管制暨預防中心 (CDC) 正採用實驗室診斷服務龍頭 LabCorp 公司和第三代定序技術領導品牌 PacBio 公司協力開發的 SARS-CoV-2 定序平台「HiFiViral for SARS-CoV-2」進行美國境內的新冠病毒變異株追蹤檢測工作。該平台能在 30 小時左右完成 900 個樣本的 SARS-CoV-2 全基因體定序,準確度高達 >99.9%,對於單核苷酸多型性 (SNPs) 與插入缺失 (Indels) 等序列變異都能夠精準地解析出來,例如在今年 1 月底該平台就檢測出美國第一個南非變種病毒 (B.1.351) 案例 [2, 3]。以下我們就帶您快速了解該平台的運作原理、流程與優勢特性。

We're proud to help support the US #COVID19 genome surveillance efforts by working with @Labcorp to increase its sequencing capacity with new Sequel II Systems and a high-throughput  #HiFiViral workflow protocol.

HiFiViral for SARS-CoV-2 工作流程

IMAGE © Geographic and Temporal Mapping of the SARS-CoV-2 Pandemic in the United States. Michael Levandoski, Ph.D., LabCorp. 2020 Dec 8 [4].

所有 SARS-CoV-2 Real-time RT-PCR 檢驗陽性的核酸樣本會被彙整到 96 孔微量盤中,藉由兩次 PCR 反應將 SARS-CoV-2 基因體以部分序列重疊的方式完整擴增出來,接著將擴增序列建構為環狀序列文庫,即可透過 Sequel II(或 Sequel IIe)定序系統進行 HiFi 定序 [4]。

HiFiViral for SARS-CoV-2 檢測原理

SARS-CoV-2 基因體會先透過反轉錄反應合成出 first strand cDNA,接著經過兩次 PCR 反應擴增出能夠完整覆蓋整個病毒基因體的序列片段,每個片段約長 1.2 kb,共 29 個片段。在此階段,源自不同樣本的擴增反應片段將會標記上不同的條碼序列以供後續分析辨識 [5]。完整實驗操作流程請見這裡

HiFiViral for SARS-CoV-2 優勢特性

較少定序片段缺失 (Fewer Dropouts)

僅需 29 個擴增片段 (amplicons) 就能完整覆蓋整個病毒基因體,引子 (primer) 黏接上的序列僅佔病毒基因體的 4.5% 左右,遠低於其它常見方法 17%~40% 比例,有效降低病毒突變造成 primer 黏不上去引起的片段缺失問題。

更容易達成引子平衡 (Easier Primer Balancing)

以 1.2 kb 的 amplicons 均勻且完整地覆蓋病毒基因體,讓 multiplex PCR 反應更容易實現,且能因應不同的樣本品質。

解析所有種類的變異 (Call All Variants)

僅需 4 倍覆蓋度 (coverage),HiFi 定序就能以 >99.9% 的準確度分析出短至 SNPs、長至 300 bp Indels 的基因序列變異 [5]。

HiFiViral for SARS-CoV-2 讓 COVID-19 變種病毒株無所遁形

IMAGE © Geographic and Temporal Mapping of the SARS-CoV-2 Pandemic in the United States. Michael Levandoski, Ph.D., LabCorp. 2020 Dec 8 [4].

上圖所顯示的是 LabCorp 團隊在去年 3 月 15 日至 5 月 21 日期間,使用 HiFiViral for SARS-CoV-2 定序 6,700 個樣本後,經過與 NCBI 資料庫中的 SARS-CoV-2 武漢分離株 (NC_045512.2) 序列比對所統計出的前 15 名病毒胺基酸突變組合。不令人意外地,大多數突變組合都帶有發生在棘蛋白 (S protein) 上的 D614G 序列變異;值得一提的是,約有 1.5% 的樣本僅帶有 S:D614G 突變 [4]。

IMAGE © Geographic and Temporal Mapping of the SARS-CoV-2 Pandemic in the United States. Michael Levandoski, Ph.D., LabCorp. 2020 Dec 8 [4].

使用 HiFiViral for SARS-CoV-2 進行大規模的樣本定序,不僅可以協助我們檢測發現新的變種病毒株,結合樣本本身的地理與時間資訊,更可以讓我們追蹤監測 COVID-19 病毒的傳播與變異分布,以擬定更即時有效的應對策略!您可以透過這個影片了解更多 LabCorp 對 6,700 個樣本的 SARS-CoV-2 定序分析報告,包含突變熱點與變異趨勢等。若您希望更進一步了解 HiFiViral for SARS-CoV-2 定序平台,歡迎洽詢 PacBio 台灣代理 — 伯森生技

References

  1. COVID-19 全球疫情地圖
  2. South Carolina Public Health Officials Detect Nation’s First Known Cases of the COVID-19 Variant Originally Detected in South Africa. South Carolina Department of Health and Environmental Control. 2021 Jan 28. [News Releases]
  3. First case of South African COVID variant detected in Virginia. WTVR-TV. 2021 Feb 05. [News]
  4. Geographic and Temporal Mapping of the SARS-CoV-2 Pandemic in the United States. Michael Levandoski, Ph.D., LabCorp. 2020 Dec 8. [Video]
  5. COVID-19 Sequencing Tools and Resources: The HiFiViral for SARS-CoV-2 Workflow enables viral sequencing and surveillance with highly accurate long reads. PacBio. [Web Page]
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