IHC 實驗該選擇酵素呈色還是螢光染色？

免疫組織化學染色法 (immunohistochemistry, IHC) 是使用抗體檢測組織切片中目標蛋白質（特定抗原）表達位置與表現程度的實驗技術。雖然不像 ELISA 能直接定量目標蛋白質的表現量，但 IHC 能直觀地顯示目標蛋白在組織、細胞或細胞結構中的定位，並同時保有組織樣本的結構特徵，因此被廣泛地應用在生物醫學研究及臨床診斷。

免疫組織化學染色依據染色步驟中是否使用到二級抗體，又可區分為直接偵測（一步法）與間接偵測（兩步、三步或多步法）。與直接偵測法相比，間接偵測法有更加優異的靈敏度。

• 直接偵測法 (Direct Detection) — 使用帶有標誌物（例如螢光染料或酵素）的一級抗體辨識樣本中的目標蛋白質，不需額外使用到二級抗體。這種方法步驟簡易、速度快，但靈敏度較低，適合用來偵測表現量豐富的目標蛋白。
• 間接偵測法 (Indirect Detection) — 需要使用帶有標誌物（例如螢光染料或酵素）的二級抗體。由於每個一級抗體通常會與兩個甚至更多的二級抗體結合，因此此方法具有訊號放大 (signal amplification) 效果，能夠提高偵測靈敏度，適合用來偵測表現量較低的目標蛋白。

無論是使用直接或間接偵測法，後續都需要藉由酵素呈色或螢光染劑觀察目標蛋白質的染色結果。依據最終呈現的染色訊號類型可區分為：

• 酵素呈色法 (Chromogenic Detection) — 透過抗體上標定的酵素將可溶性呈色劑 (substrates, chromogens) 轉化為不溶性的色素沉澱物，進而產生訊號。最為常用的酵素包括能將 DAB 轉化為棕色產物的 HRP (horseradish peroxidase) 酵素，以及能將 BCIP/NBT 呈色劑轉化為藍色產物的 AP (alkaline phosphatase) 酵素。與螢光染劑不同，酵素呈色法所生成的色素沉澱物具有光穩定性，這使得使用此方法的染色切片能夠穩定保存多年。但需提醒的是，若是使用 HRP 反應受質進行偵測，組織中的內源性過氧化酶 (endogenous peroxidase) 也會和呈色劑作用產生非專一性訊號，因此在使用 HRP 標定的抗體進行實驗前，需先用 0.3％ 過氧化氫溶液 (0.3% H₂O₂ in TBS) 處理組織，阻斷 (blocking) 內源性過氧化酶。
• 螢光染色法 (Fluorescent Detection) — 此方法是使用標定有螢光染料（例如 FITC, Alexa Fluor®, DyLight®, Texas Red...）的抗體進行染色。由於在切片上很難區分兩種以上的酵素呈色訊號，而螢光檢測可在不同波長下激發多個螢光染劑，因此螢光染色法更適合用來進行多重染色 (multiplex IHC)，亦即同時檢測三種以上的目標蛋白質（包括細胞核染色）。在設計螢光多重染色實驗時，必須考慮以下兩個關鍵點：(1) 盡量避免選用發射光譜 (emission spectrum) 重疊的螢光染劑；(2) 如果採用間接偵測法，應盡可能避免交叉反應 (cross reactivity)，這部分可透過選擇不同物種來源的一級抗體來確保每支二級抗體在實驗中僅會辨識到單一種一級抗體。另外需特別提醒的是，一般組織固定 (fixation) 用的醛類固定劑（例如福馬林）在使用過程中會產生游離醛基 (free aldehyde group)，與抗體胺基結合後會產生自體螢光 (autofluorescence)，導致高背景值。若要減少自體螢光的干擾，可以在阻斷液 (blocking buffer) 中加入甘氨酸 (0.3M glycine) 以消除游離醛基。

以上談論了那麼多，我們為您總結以下適用的情境：

酵素呈色法
▶ 僅要偵測單一目標蛋白質
▶ 目標蛋白表現量低
▶ 需要長期保存樣本

螢光染色法
▶ 需要同時檢測多個目標蛋白質或是觀察共定位
▶ 目標蛋白表現量高
▶ 需要高解析度影像

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