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友善列印Morpholino 反義核酸合成服務

Morpholino 的應用與特點

過去在使用反義 (antisense) 抑制實驗來探討基因功能時,常因為反義核酸的不穩定、專一性差或效率低等問題,而造成實驗的限制。美國 Gene Tools 公司獨家推出的 Morpholino Oligo,將可解決這些困擾研究人員以久的缺陷,讓您的實驗更加簡便而精確。

Morpholino oligo 是將 6 碳環之 Morpholine 接上鹼基後,以非離子性的 phosphorodiamidate 連接而成 (如下圖所示)。相較於過去在反義抑制實驗中常用的 Phosphorothioate 及 PNA,Morpholino 能有更好之效率及專一性;較簡便的使用方式而且較為便宜。

Morpholino Oligos 特點
穩定性高
(具核酸水解酵素 (nuclease) 抵抗性)
可穩定存留於細胞內較長的時間可避免產生出具毒性的裂解物質。
效率高 即使作用濃度僅有 nanoMolar,也能有優越的抑制效果。
不須 RNase H 可避免 RNase H 對與目標 RNA 相似的非目標 RNA 產生 裂解作用。
序列專一性高 其專一性為 Phosphorothioate 的 100 倍,即使在高濃度狀況 下使用也不會降低其專一性。
對目標 RNA 結合能力好 可侵入目標 RNA 的二級結構,達到穩定結合的目的。
在細胞質及細胞核內皆有活性 可增加 Morpholino oligo 作用的機會。
在無細胞系統及細胞內皆適用 Morpholino oligo 在有、無細胞之系統下,皆有良好之反義活性。
不受血清影響 不會與血清中之白蛋白 (albumin) 結合而降低其活性。
溶解度好 溶解度可高達100 mg/mL,且在保存過程中不易有沉澱發生。
Oligo 長度最長 最長可提供至 25 mer 的 Morpholino oligo (為目前市售最長的)。即使
長度增加至 25 mer,仍能保有高專一性。
快速簡單的遞送方式 針對貼附型細胞可透過簡單的刮細胞方式 (Scrape Delivery) 將 Morpholino oligo 運送入細胞中作用,避免使用 Liposome 所造成的細胞毒性,遞送效率高(可高達 85~90%)。
經濟實惠 價格較一般反義核酸便宜。

siRNAs vs. Morpholinos
siRNA versus Morpholino
YES More than 500 publications YES
NO Allows you to modify splicing YES
NO Effective & specific in embryos YES
NO Free of off-target effects YES
NO Free of interferon effects YES
NO Typical first-try targeting success YES
NO Functions in both cytosol & nucleus YES
NO Complete stability & long-term efficacy YES
NO Well understood mechanism YES

如何挑選 Morpholino Antisense Oligos 的作用區域

  • 針對 post-spliced mRNA 上,由 5'-cap 到轉譯起始點 3' 端 25 個 bases 左右的這一段區域為最佳設計區段。
  • Morpholino oligo 的 self-complementarity 部分不可超過 4 個 bases。
  • Morpholino oligo 的 G 含量最好不要超過 36% (因為會降低 oligo 的溶解度)。
  • Morpholino oligo 的長度越長越好 (最長 25 個 mer),然而 Morpholino oligo 的價格並非以長度來計算,因此同濃度情況下,25 mer 的 Morpholino oligo 不會比 18 mer 的 Morpholino oligo 來得昂貴。

Morpholino Antisense Oligo 的運送

在細胞實驗方面可藉由電穿孔 (electrophoration) 或使用 Gene Tools 公司所開發的專利 "Endo-Porter" 試劑將 Morpholino oligo 送入細胞中作用;貼附型細胞還可簡單利用刮細胞的方式將 Morpholino oligo 送入細胞中,歡迎洽詢索取詳細實驗流程。

Endo-Porter is a weak-base amphiphilic peptide that was designed to deliver Morpholino oligos, peptides or proteins into the cytosol of cultured cells by an endocytosis-mediated process. The mechanism of delivery entails rapid adsorption of Endo-Porter to cell surfaces, but this adsorption to the cell surface does not damage the plasma membrane. The membrane-bound Endo-Porter is rapidly endocytosed, along with Morpholinos in the medium. Natural acidification of the endosome protonates Endo-Porter that, in its ionic form, permeabilizes the endosome and releases the endosome contents into the cyotosol.

在動物實驗方面 Gene Tools 公司最新研發的 "Vivo-Morpholinos" 是在一般 Morpholino oligo 序列 3' 端連結了由八個 Arginine 胺基酸結構中的帶正電基團 "Guanidium Group" 所組成的支鏈,此支鏈可協助 Morpholino oligo 以內吞作用 (endocytosis) 進入動物細胞中。目前已有多個小鼠及狗的成功案例顯示,藉由簡單的靜脈或腹腔注射方式即可讓 Vivo-Morpholinos 於動物體內發揮有效作用,且數據顯示 Vivo-Morpholinos 毒性極低非常適合動物實驗使用。歡迎洽詢索取詳細產品使用方式。


(A) Morpholino
oligo is a non-charged antisense oligonucelotide agent in which the ribose sugar is replaced by a six-membered morpholino ring and the phosphodiester bond is replaced by a phosphoroamidate linkage. (B) Vivo-Morpholinos are Morpholino oligos coupled with eight guanidinium head groups on dendrimer scaffolds that enable Morpholino applications in adult animals.

Photo Morpholinos - 以光調節基因抑制時機與區域

"Photo Morpholinos" 是 Gene Tools 公司最新開發的基因抑制工具,相較於一般 morpholino,Photo-Morpholinos 是在 25mer morpholino oligo 序列中間鑲嵌了一個光裂解的結構,此結構經由 365nm 光源照射即會斷裂,使得 morpholino oligo 斷裂成兩個片段,失去與標的序列結合作用的能力。藉由善用 Antisense- 與 Sense- Photo-Morpholino 的實驗設計,與控制光源照射時間與位置,研究者可輕鬆調控基因抑制的發生時機與區域,其應用包含:避免基因抑制而造成胚胎死亡、針對特定區域或特定時間點進行基因抑制等。


Photo Morpholinos 實驗設計與應用:(A). Antisense Photo-Morpholinos strategy —
設計為 Antisense 的 Photo-Morpholinos 原本可以抑制目標基因,當使用 365nm 光源照射後,即會使得 Photo-Morpholinos 裂解並失去抑制作用,造成基因再次被表現。可應用於在特定時間解除基因抑制作用,重新開啟基因表現。 (B). Sense Photo-Morpholinos strategy — 設計為 Sense 的 Photo-Morpholinos 其序列與目標基因相同,當與一般 MO antisense oligo 一同送入細胞內後,Photo-Morpholinos 會先結合上 MO antisense oligo,使得目標基因暫時不被抑制。當於特定時間點給予 365nm 光源照射後,MO antisense oligo 即被釋放,發揮基因抑制作用。可應用於在特定時間點抑制基因表現。



Lightbox:
由 Gene Tools 公司出品的「Lightbox」內有 365nm LED 燈源,可設定光源照射時間,作為 Photo-Morpholinos 實驗之裂解光源使用。

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