Collagen 實驗技巧

膠原蛋白 (Collagen) 是一個廣泛存在卻又高度保守的蛋白質家族，其特徵為連續的甘胺酸 (Glycine)-X-Y 三聯體重複序列，從而形成三股螺旋結構。由於不同類型的膠原蛋白間具有高度相似的三股螺旋結構，使得建構某種膠原蛋白的專一性抗體較為困難且富有挑戰性。

為了使某一種膠原蛋白抗體具有專一性，生成抗體所用的免疫抗原必須仰賴於未變性的三維膠原蛋白表位，或者僅存在於該特定膠原蛋白中的短肽序列。研究者需要根據所使用的膠原蛋白抗體類型，謹慎適時地調整實驗方案才能獲取精確的實驗成果。在此提供您幾點實驗注意事項和技巧，幫助您從膠原蛋白抗體取得預期的結果。

使用辨識未變性三維膠原蛋白抗體的
實驗注意事项

如果您正在使用通過未變性三維表位而研發的膠原蛋白抗體，那麼在實驗過程中必須要小心避免膠原蛋白的變性。如果膠原蛋白變性或者使用了福馬林固定、石蠟包埋，抗體的反應性會降低。以下為您提供一些調整實驗方案時的考量方向與建議。

ELISA

• 使用具有天然三維結構的膠原蛋白標準品
  由於膠原蛋白序列的高度相似性，只有三級結構才具有足夠的差異以區分不同類型的膠原蛋白。因此在採用辨識未變性三維膠原蛋白抗體時，使用具有天然三維結構的膠原蛋白標準品是必須的。
• 推薦使用 Sandwich ELISA
  在採用辨識未變性三維膠原蛋白抗體時，推薦使用 Sandwich ELISA 方式，因為這種方式能保持天然膠原蛋白結構。不推薦使用間接 ELISA，因為這種方式是將膠原蛋白直接連接到 ELISA plate 上，可能會破壞膠原蛋白的天然結構，導致抗體難以辨識。

Western Blot

• 注意 pH、溫度和濃度，防止膠原蛋白聚合
  膠原蛋白在酸性條件下可溶，在鹼性 pH 下膠原蛋白會聚合形成凝膠，因此酸性 pH 對膠原蛋白的穩定性和可溶性至關重要。此外，如果膠原蛋白濃度太高，也會導致凝膠的形成。而由於膠原蛋白比其他蛋白質更不穩定，實驗應在 <10℃ 下進行。
• 最適化電泳條件
  > 在樣品中加入洗滌劑、還原劑和變性劑 (Chaotropic agents)。
  > 膠原蛋白 I、II、III 使用 6% acrylamide 凝膠。
  > 膠原蛋白 IV、V、VI 使用 10% acrylamide 凝膠。
  > 梯度凝膠可能更適合用於展示全長片段和更小的片段。
• 推薦陽性和陰性對照：推薦使用天然膠原蛋白質標準品作為陽性和陰性對照。
• 推薦抗體稀釋度：0.5-1 μg/ml。

IHC - 福馬林固定、石蠟包埋

• 確定交聯程度，並選擇合適的抗原修復條件
  當膠原蛋白的三重螺旋排列形成纖絲進而形成纖維時，膠原蛋白中可能發生交聯。交聯程度將決定曝露表位所需的抗原修復條件。Picrosirius red (ab150681) 染劑可專一性地結合至纖維膠原蛋白 (I–V 型) 的 [Gly-X-Y]n 螺旋結構上，因此可用於確定膠原蛋白的交聯程度。若可能，應盡可能地減少嚴苛的抗原修復條件，避免破壞膠原蛋白的三級結構。我們推薦使用 Sodium citrate 緩衝液 (pH 6.0) 進行抗原修復，然而酵素切割方式也很常用。請始終按照抗體說明書上所列的推薦抗原修復方法。
• 推薦抗體稀釋度：1:500-1:2000

使用辨識短肽序列膠原蛋白抗體的
實驗注意事项

如果您正在使用通過辨識短肽序列而研發的膠原蛋白抗體 (例如 ab138492)，無需特別小心地保持膠原蛋白的三維結構。Abcam 所有的 RabMAb® 膠原蛋白抗體都是使用合成短肽免疫製成的，對目標膠原蛋白具有序列專一性。使用通過辨識短肽序列而研發的膠原蛋白抗體，能讓您以一般常規的 Western Blot、ELISA 或 IHC 實驗流程進行檢測，無需額外考慮調整實驗方案。

選擇合適的膠原蛋白抗體

Figure 1 Formalin/PFA-fixed paraffin-embedded sections of human colon tissue staining Collagen I with unpurified ab138492 in IHC analysis. Figure 2 ab21286 staining Collagen I (red) in mouse colon tumor cells by ICC/IF. Figure 3 IF analysis of human articular chondrocytes, staining Collagen II with ab34712. Figure 4 IHC analysis of paraffin-embedded human liver tissue labeling Collagen VI with ab182744.

更多膠原蛋白實驗技巧說明，請見：https://www.Abcam.com/protocols/collagen