實用 Protocol 介紹
磷酸化蛋白質 WB 檢測

磷酸化蛋白質樣本製備要點

• 採用新鮮配製的裂解緩衝液 (Lysis buffer) 來均質化細胞或組織樣本，並在使用前新鮮加入【蛋白酶抑制劑 (Protease inhibitors) 】與【磷酸酶抑制劑 (Phosphatase inhibitors)】，以確保裂解緩衝液內的抑制劑能夠提供最佳作用活性。
• 樣本一旦開始均質裂解，同時也會伴隨產生蛋白質水解、去磷酸化、變性等變化。使用含有適當抑制劑的裂解緩衝液與低溫環境，可明顯減緩這些負面反應的發生。因此操作磷酸化蛋白質樣本時，務必全程置於冰上或處於 4°C 低溫狀態。
• Abcam 建議使用添加有【Protease and phosphatase inhibitor cocktails】的 RIPA 或 NP40 作為裂解緩衝液。

Western Blot 實驗流程

1. 在含有 1-100 ng 標的磷酸化蛋白質（500 µg 裂解物）的蛋白質樣本溶液中加入等體積的 2X SDS-PAGE 樣本緩衝液 (Sample buffer)。若欲分析還原狀態 (Reduced) 的蛋白質樣本，樣本緩衝液需額外加入 DTT 或 β-mercaptoethanol；若欲分析的是非還原狀態 (Non-reduced) 的蛋白質樣本，則不需加入 DTT 或 β-mercaptoethanol。
2. 將樣本以 95°C 加熱或煮沸 5 分鐘，使蛋白質變性。
3. 將樣本注入 SDS-PAGE 膠體孔槽中，並以標準電泳條件進行跑膠。
4. 透過半乾式 (Semi-dry) 或全濕式 (Wet) 轉漬法將蛋白質樣本轉印至 PVDF 轉漬膜上。 📌 PVDF 轉漬膜必須預先以甲醇 (Methanol) 溶液活化後，方可適用於轉漬實驗。
5. 如有需要，可使用麗春紅 (Ponceau) 染劑對轉漬膜進行簡單染色（約 10 秒），以確認轉漬效率。之後可使用 PBST 或 TBST 洗去染劑。 📌 我們不建議使用蒸餾水沖洗轉漬膜，因為在某些情況下可能會使印在膜上的蛋白質脫落下來。
6. 使用 TBST 配製成 5% w/v BSA 溶液作為阻斷液 (Blocking buffer)。將轉漬膜置於其中，於 4°C 溫和搖晃反應 1 小時。
7. 使用 TBST 稀釋一級抗體，並將轉漬膜置於其中，於 4°C 溫和搖晃反應一晚。 📌 我們推薦在密封袋、雜交管或 50 ml Falcon 管中進行反應，每片轉漬膜約使用 2.5 ml 一級抗體溶液。
8. 於室溫下，使用 TBST 沖洗轉漬膜 3~4 次，每次 5 分鐘。
9. 使用 TBST 稀釋標定有 HRP (Horseradish peroxidase) 酵素的二級抗體。將轉漬膜置於其中，於室溫下溫和搖晃反應 1 小時。
10. 於室溫下，使用 TBST 沖洗轉漬膜 3~4 次，每次 5 分鐘。
11. 使用 ECL 冷光試劑進行呈色反應與偵測。

注意事項

• 確保蛋白質樣本保持在磷酸化的狀態！記得使用新鮮配製的裂解緩衝液，並在裂解緩衝液中加入充足的磷酸酶抑制劑；同時確保樣本操作時，始終置於冰上或處於 4°C 低溫狀態。
• 磷酸化反應可能需要被誘導產生！若 Western blot 實驗僅能偵測得到微弱的磷酸化蛋白質訊號（甚至是幾乎完全無訊號），有可能是該蛋白質的磷酸化反應不夠充分所導致。因此在進行 Western blot 實驗時，務必同時檢測陽性對照組。
• 使用 5% w/v BSA (fractionV) 而非牛奶進行阻斷反應！因為牛奶成分中含有酪蛋白 (Casein)，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白質，有可能會與一級抗體產生交叉反應，導致高背景值。

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