高準確度的長讀取基因定序技術「HiFi 定序」帶來哪些突破與進展？

如同華盛頓大學醫學院 Evan E Eichler 教授在其最近刊載於《Nature Reviews Genetics》期刊的文章中所說的，長讀取定序 (Long-read sequencing) 技術的出現，讓我們得以用新的角度與深度來剖析了解生物體內的 DNA 與 RNA 序列 [1]。以下我們就帶您快速了解長讀取基因定序技術帶來哪些突破與進展？

相較於 NGS (Next-generation sequencing) 次世代定序技術每一個定序片段長度僅有 <300 bp、且需要仰賴 PCR 擴增技術放大 DNA 樣本，長讀取定序技術每一個定序片段長度可長達 10 kb 至數 Mb，且樣本不需經過 PCR 擴增放大。長讀取定序技術的出現，讓我們首次得以探尋包含端粒 (Telomeres) 等重複序列區域（另有著絲粒 (Centromeres) 與高 GC 含量區域等），並藉由更精確的單倍體 (Haplotype) 全長序列資訊，發掘出許多過去未曾能被發現的序列變異，特別是基因體結構變異 (Structural variants, SVs) [1-4]。

圖 1﹑相較於 NGS 技術，長讀取定序技術可檢測出更多的 SVs。根據 Chaisson 研究團隊的實驗結果，長讀取定序技術檢測出的 SVs 數量約為 NGS 技術的近 2.5 倍 [4]。IMAGE © Pacific Biosciences.

根據 Chaisson 研究團隊的評比實驗結果，長讀取定序技術檢測出的 SVs 數量約為 NGS 技術的近 2.5 倍 （圖 1），絕大部分的 SVs 無法被 NGS 所測得 [4]。這是因為 SVs 這類基因體序列變異具有較長的序列影響長度（≥50 bp），且變異發生位置往往座落在重複序列範圍內，這些特性都導致 SVs 不易被短讀序 (Short read) NGS 技術所偵測得到 [1-4]。而隨著長讀取定序技術的躍進，已有越來越多的人類罕見疾病相關 SVs 相繼被披露，包含神經發展障礙症 (Neurodevelopmental disorders, NDDS)、性聯遺傳肌張力障礙帕金森症候群 (X-linked dystonia-parkinsonism, XDP)、肌萎縮性側索硬化症 (Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、肌抽躍型發作癲癇 (Myoclonic epilepsy)、肌肉強直症 (Myotonic dystrophy)、X 染色體脆折症 (Fragile X syndrome) 等 [1, 2, 5]。

長讀取定序技術在引領我們更全面精準地掌握基因體序列 (Whole-genome sequence) 資訊的同時 [6. 7]，也加速推動了我們對轉錄體 (Transcriptome)、RNA 異構物 (RNA isoforms) [8, 9, 10]、複雜基因區域（例如 HLA 基因）[11]、以及表觀遺傳修飾 [12, 13] 有更深入精確的了解。

當前定序技術最新評比結果

目前最具代表性的長讀取定序技術分別來自 Pacific Biosciences (PacBio) 與 Oxford Nanopore Technologies (ONT) 公司。華盛頓大學醫學院 Evan E Eichler 教授研究團隊比較了這兩種長讀取定序技術與 NGS 在定序準確度 (Accuracy)、通量 (Throughput) 與成本花費 (Cost) 的差異。從表格中，我們可以看到 NGS 作為目前主流的定序技術，具有高達 >99.9% 的準確度；而與其準確度最為接近的長讀取定序技術則是來自 PacBio 公司的 HiFi (High fidelity) 定序結果，其準確度為 >99% [1]。

表 1﹑PacBio 公司的 HiFi 定序結果準確度高達 >99%，是最接近 NGS 準確度的長讀取定序技術 [1]。IMAGE © Nat Rev Genet. 2020 Oct;21(10):597-614. Table 1.

作者們進一步比較 PacBio 與 ONT 各個定序方式在定序長度與準確度的差異性。從圖 2 中可以看出，儘管 ONT 具有較長的定序長度，然而其準確度卻無法得到有效提升，離 Q20（即 99%）仍有一段相當大的距離。作者們在文中即表示 "PacBio HiFi sequence reads... are the first data type that is both long (greater than 10 kb in length) and highly accurate (greater than 99%)." [1]。

圖 2﹑儘管 ONT 具有較長的定序長度，然而 PacBio 公司 HiFi 定序結果卻是唯一可以兼顧長讀值與高準確度 (>99%) 的長讀取定序技術 [1]。IMAGE © Nat Rev Genet. 2020 Oct;21(10):597-614. Fig. 3c.

HiFi 長讀取定序技術 — 強大便利的研究工具

具有堪比 NGS 準確度的 HiFi 長讀取定序技術，已廣泛地運用在 Telomere-to-Telomere Consortium、Human Pangenome Project、SOLVE-RD 等多項大型基因體定序計畫中。您可以透過這段 2 分鐘的短片快速認識 HiFi 定序技術。若您想進一步了解在您的研究主題中，HiFi 定序技術可以如何成為您探尋真理的堅實助力，歡迎洽詢 PacBio 台灣代理 — 伯森生技。

本篇內容源自 PacBio 與 Gene Company 公司，伯森生技已獲其許可進行重製與轉載分享。

References

1. Logsdon GA, Vollger MR, Eichler EE. Long-read human genome sequencing and its applications. Nat Rev Genet. 2020 Oct;21(10):597-614. PMID: 32504078
2. Xiao T, Zhou W. The third generation sequencing: the advanced approach to genetic diseases. Transl Pediatr. 2020 Apr;9(2):163-173. PMID: 32477917
3. Mahmoud M, et al. Structural variant calling: the long and the short of it. Genome Biol. 2019 Nov 20;20(1):246. PMID: 31747936
4. Chaisson MJP, et al. Multi-platform discovery of haplotype-resolved structural variation in human genomes. Nat Commun. 2019 Apr 16;10(1):1784. PMID: 30992455
5. Susan M. Hiatt, et al. Long-read genome sequencing for the diagnosis of neurodevelopmental disorders. bioRxiv 2020.07.02.185447; DOI: 10.1101/2020.07.02.185447
6. Sherman RM, Salzberg SL. Pan-genomics in the human genome era. Nat Rev Genet. 2020 Apr;21(4):243-254. PMID: 32034321
7. Miga KH, et al. Telomere-to-telomere assembly of a complete human X chromosome. Nature. 2020 Sep;585(7823):79-84. PMID: 32663838
8. Qiao Y, et al. High-resolution annotation of the mouse preimplantation embryo transcriptome using long-read sequencing. Nat Commun. 2020 May 27;11(1):2653. PMID: 32461551
9. Shinichi Namba, et al. Multi-sample Full-length Transcriptome Analysis of 22 Breast Cancer Clinical Specimens with Long-Read Sequencing. bioRxiv 2020.07.15.199851; DOI: 10.1101/2020.07.15.199851
10. Anoushka Joglekar, et al. Cell-type, single-cell, and spatial signatures of brain-region specific splicing in postnatal development. bioRxiv 2020.08.27.268730; DOI: 10.1101/2020.08.27.268730
11. Chen J, et al. [The third-generation sequencing combined with targeted capture technology for high-resolution HLA typing and MHC region haplotype identification]. Yi Chuan. 2019 Apr 20;41(4):337-348. PMID: 30992255
12. Oliveira PH, et al. Epigenomic characterization of Clostridioides difficile finds a conserved DNA methyltransferase that mediates sporulation and pathogenesis. Nat Microbiol. 2020 Jan;5(1):166-180. PMID: 31768029
13. Ishiura H, et al. Noncoding CGG repeat expansions in neuronal intranuclear inclusion disease, oculopharyngodistal myopathy and an overlapping disease. Nat Genet. 2019 Aug;51(8):1222-1232. PMID: 31332380