[抗體實戰技巧] PD-L1 實驗成功小撇步 | Abcam

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PD-L1 實驗成功小撇步

PD-L1 是一個 33 kDa 的跨膜蛋白,在多種腫瘤組織中高度表現。隨著 PD-1/PD-L1 免疫檢查點研究的不斷開發與深入,已有多個 PD-1/PD-L1 抑製劑藥物(例如 Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab、Nivolumab、Pembrolizumab 等)進入臨床作為非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀上皮癌、腎細胞癌、泌尿上皮癌、黑色素瘤、何杰金氏淋巴瘤等疾病的二線甚至一線治療藥物 [1, 2]。

病患癌症組織的 PD-L1 表現量可用來作為預測藥物療效或是衡量病患是否適合接受 PD-1/PD-L1 抑製劑藥物的評估指標。然而由於 PD-L1 的重度醣基化,使得 PD-L1 的 IHC-P 或 Western Blot 檢測極具挑戰性 [2]。以下我們特別整理了 PD-L1 的實驗注意事項,期望能幫助您取得更精確的 PD-L1 檢測結果!

PD-L1 的 IHC-P 檢測注意事項

當 PD-L1 的 IHC-P 檢測結果訊號不佳時,可嘗試使用醣苷水解酶 PNGase F (peptide-N-glycosidase F) 處理組織樣本,使 PD-L1「去醣基化」。去醣基化後的 PD-L1 可以更容易地被 PD-L1 抗體所辨識,進而提升 PD-L1 的 IHC 偵測靈敏度(圖 1)[2]。

圖 1﹑使用 PNGase F 處理兩個不同病患來源的肺癌組織樣本,再以 Recombinant Anti-PD-L1 antibody [28-8] (ab205921) 進行 IHC 染色。可觀察到 D1 病患組織在去醣基化處理後,PD-L1 的訊號獲得顯著增強。 IMAGE © Cancer Cell. 2019 Aug 12;36(2):168-178.e4. Figure 2F [2].

欲使用 [28-8] 克隆的 PD-L1 單株抗體進行 IHC 檢測時,建議選用 Abcam 所推出的【便利組合包產品 (ab236676)】,裡面除了含有 PD-L1 [28-8] 單株抗體 (ab205921) 以外,尚包含有抗原修復液 (ab208572) 與配套的訊號放大呈色試劑組 (ab209101)。在進行抗原修復時,則建議採用高壓蒸氣修復切片 2 分鐘(或 120℃ 30 秒,110℃ 15 分鐘),以獲得更好的實驗結果。

圖 2﹑使用 Abcam 組合包產品【PD-L1 antibody (28-8) IHC antigen retrieval and detection panel (ab236676)】進行 PD-L1 IHC 染色。 IMAGE © Abcam.

PD-L1 的 Western Blot 檢測注意事項

由於醣基化等後轉譯修飾的存在,使得 Western Blot 檢測到的 PD-L1 條帶位置往往會落於 40~60 kDa 區間,而非預期的 33 kDa。除此之外,PD-L1 在不同細胞株的表現情形也會有所不同(圖 3),因此為了確保實驗的正確性,建議在進行 Western Blot 實驗時同時涵蓋陽性對照組(PD-L1 表現細胞)以及陰性對照組(PD-L1 基因剔除細胞)樣本

圖 3﹑使用 Recombinant Anti-PD-L1 antibody [EPR19759] (ab213524) 檢測 PD-L1 在多種細胞株的表現情形。 IMAGE © Abcam.

若想進一步確認 Western Blot 實驗結果中的條帶是否為 PD-L1,可先使用 PNGase F 處理樣本,再觀察去醣基化後的 PD-L1 條帶位置是否發生改變,改為落在 33 kDa 位置(圖 4)[2]。

圖 4﹑使用 PNGase F 處理細胞溶解物樣本後,Western Blot 檢測出的 PD-L1 條帶位置即與預期的分子量大小一致。 IMAGE © Cancer Cell. 2019 Aug 12;36(2):168-178.e4. Figure S1A & S1C [2].

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References

  1. Wei Y, et al. Immune landscape and therapeutic strategies: new insights into PD-L1 in tumors. Cell Mol Life Sci. 2020 Sep 17. PMID: 32940722
  2. Lee HH, et al. Removal of N-Linked Glycosylation Enhances PD-L1 Detection and Predicts Anti-PD-1/PD-L1 Therapeutic Efficacy. Cancer Cell. 2019 Aug 12;36(2):168-178.e4. PMID: 31327656
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