專家都在用的「轉染效率」測量法

專家都在用的「轉染效率」測量法

轉染 (Transfection) 是將外源核酸物質 (如 DNA, RNA, RNP…) 輸送進入細胞的基因修飾技術，被廣泛運用於基因功能、基因調節、蛋白質功能等研究，以及生產重組蛋白、重組慢病毒的製程。除了使用 Western Blot (WB)、免疫組織化學染色 (IHC)、功能性試驗 (Functional assay) 等方法驗證基因編輯結果之外，在一些情況下，研究人員會需要先評估實驗條件對轉染效率 (Transfection Efficiency) 的影響。以下我們將為您介紹兩類較常使用的核酸輸送效率偵測方法：「直標核酸法 (Direct Nucleic Acid Labeling)」和「報導基因檢測法 (Reporter Assay)」，同時也將簡單介紹相關實驗工具。

直標核酸法 (Direct Nucleic Acid Labeling)
報導基因檢測法 (Reporter Assay)
更多高效便捷的轉染實驗工具

直標核酸法 (Direct Nucleic Acid Labeling)

這是觀察核酸輸送效率最直接的方式，不需要透過外加報導基因、等待產物生成、後續測試，只要將目標核酸標定螢光或其他標記 (Tag)，即可追蹤核酸送入細胞內的情況，觀察核酸輸送效率。直標核酸法又可區分為：

化學標記法：標定試劑透過反應基 (reactive group) 與核酸產生結合，例如 Label IT® Labeling Reagents 即是透過烷基化 (alkylating) 反應基和核酸的雜環作用，形成共價鍵結達到標定效果。
酵素標記法：透過酵素催化核酸合成反應，將帶有標記的核苷酸 (labeled nucleotide) 加入核酸，進而實現核酸標定。

經過標記的核酸，通常會採用下列其中一種方式進行偵測：

直接偵測法：依核酸的標記物，採用可見光、冷光 (chemiluminescent) 或是螢光偵測的方式觀察轉染效率。
間接偵測法：先將核酸接上如 Biotin, Digoxin, DNP 等標記物，再使用會與標記物作用的分子 (如 Streptavidin) 進行訊號偵測。

Label IT siRNA Tracker Cy3 Kit 應用實例 - Mirus Bio 台灣獨家代理伯森生技

圖 1﹑使用 Label IT® siRNA Tracker™ Cy®3 Kit 將 siRNA 進行標定後，從小鼠尾端靜脈進行注射輸送，並於 30 分鐘後採集小鼠肝臟，固定、包埋、切片並觀察轉染效率。(A) 圖為使用100 µl 低量體積注射，(B) 圖則是以高壓注射 (Hydrodynamic injection, 2 ml, 6-8 seconds)。從實驗結果來看，採用低量體積注射時，siRNA 只會停卡在肝血竇 (sinusoid, s)；而使用高壓注射則可以有效將 siRNA 送入肝細胞 (hepatocyte, h)，達到更優異的核酸輸送效率。

報導基因檢測法 (Reporter Assay)

報導基因檢測法是將待轉染的核酸與報導基因融合 (fusion)，或直接將報導基因轉染至細胞後，藉由偵測報導基因產物得知核酸輸送的效率。常用的報導基因有：

螢光蛋白 (Fluorescent Protein)：常見於海洋生物的內源性蛋白 (如 GFP, YFP)，研究人員可以藉由定性或定量的方式檢測螢光訊號，藉此得知轉染效率。

螢光蛋白的定性分析 (Qualitative analysis) - 透過「螢光顯微鏡」直接觀察螢光表現細胞所佔百分比 (%)，是迅速、直觀的檢測方法，但也可能因為顯微鏡視野的不同而有所偏差。

螢光蛋白的定量測量 (Quantitative measurement) - 使用「流式細胞儀」測量螢光表現細胞佔細胞族群中的百分比 (%)，是準確、客觀的檢測方法。

TransIT-LT1 應用實例 - Mirus Bio 台灣獨家代理伯森生技

圖 2﹑使用 TransIT®-LT1 將報導基因 ZsGreen expressing plasmid 轉染到 Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) 中，(A) 圖是利用相位差顯微鏡拍攝得的細胞影像，(B) 為透過螢光顯微鏡的定性分析，而 (C) 則是用流式細胞儀的定量測量。

冷光酵素 (Luciferase)：Luciferase 能夠在 ATP 存在下催化冷光素 (Luciferin)，生成冷光。冷光酵素報導基因檢測法具有高靈敏度、偵測範圍廣、能夠定量等優點，是用來比較樣本間相對轉染效率的理想選擇。

TransIT-X2 應用實例 - Mirus Bio 台灣獨家代理伯森生技

圖 3﹑使用冷光酵素報導基因檢測法比較三款轉染試劑產品 TransIT-X2®、Lipofectamine® 2000、Lipofectamine® 3000 的轉染效率。

β-半乳糖苷酶 (β-Galactosidase, β-Gal)：源自大腸桿菌 LacZ 基因的酵素，可以與其基質 (substrate) 作用後產生呈色 (chromogenic)、螢光或化學冷光等訊號。

β-Gal 的定性分析 - 在欲偵測轉染效率的細胞中加入呈色基質，例如 X-Gal。轉染成功的細胞 (表現有 β-gal) 可與基質作用反應產生藍色沉澱染料。透過觀察染色細胞多寡，即可評估轉染效率。

β-Gal 的定量測量 - 使用產生冷光或螢光的基質 (如: MU-Gal) 進行檢測。雖然具有高靈敏度，但需要將細胞裂解才能進行偵測。

分泌鹼性磷酸酶 (Secreted Alkaline Phosphatase, SEAP)：表現 SEAP 報導基因的細胞會分泌鹼性磷酸酶 (AP) 到細胞培養基中，因此不需要將細胞裂解即可取樣測試。依基質種類，SEAP 可以使用可見光或螢光進行檢測。

更多高效便捷的轉染實驗工具

除了上述方法，您也可以使用即用型 (ready-to-use) 預標記核酸，這些預先標記好螢光的 DNA 或 RNAi 片段，可以做為 in vitro 或 in vivo 核酸輸送實驗的參考對照組 (Control)。

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