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友善列印AlphaScreen SureFire Cellular Kinase Assay Kits

AlphaScreen® SureFire® 是由美商 PerkinElmer 所研發出的新型態細胞內磷酸化蛋白質偵測技術。此技術幾乎不具有任何技術門檻,只要會使用 Pipetman 就可以進行實驗!流程簡單,從拿到待測檢體開始到取得偵測結果,只要三個步驟就能完成。AlphaScreen SureFire 除了具有無技術門檻以及操作流程簡單的特性之外,還擁有優於 Western Blot、ELISA 的偵測靈敏度與偵測區間,不但可減少樣品用量、提高解析度、並且具有量化的數據顯示方式,彌補了傳統 Western Blot 與 ELISA 的不足之處。

*本系列產品亦可適用於細胞內非磷酸化蛋白質的偵測,例如:GAPDH, Akt, Erk, p53, Topo IIa 等,詳情請見訂購資訊

 

產品特點:

  • 偵測靈敏度高,細胞可不經任何基因轉染 (transfection) 或大量表現 (over-expression) 過程,即可直接進行偵測。
  • 適用多種哺乳動物細胞株以及初代細胞 (primary cell)。
  • 全均質化 (homogeneous) 操作步驟,流程簡單且不需分離或洗滌步驟,可快速完成偵測實驗。
  • 產品種類豐富,涵蓋各種熱門細胞訊息傳遞路徑,如:Akt, JAK/STAT, MAPK, mTOR, NF-kB, TGFb/Smad signaling pathway 等。
實驗步驟 Western Blot ELISA AlphaScreen SureFire
0 取得待測檢體
取得待測檢體 取得待測檢體
1 電泳 加入反應試劑
加入反應試劑
2 轉漬 清洗 x 3次 加入偵測試劑
3 Blocking 加入偵測抗體 偵測
4 1st 抗體結合 清洗 x 3次  
5 清洗 x 3次 加入 2nd 抗體  
6 2nd 抗體結合 清洗 x 3次  
7 清洗 x 3次 加入呈色劑  
8 呈色反應 加入終止反應劑  
9 偵測 偵測  

 

作用原理:

AlphaScreen® SureFire® 作用原理類似 Sandwich ELISA,以下圖「AlphaScreen SureFire p-Erk」偵測試劑為例,當 cell lysates 樣品中含有待測的特定磷酸化蛋白質 "p-Erk" 時,帶有 Erk 專一性抗體的 Donor Bead、與帶有 phospho Erk 專一性抗體的 Acceptor Bead,就能夠經由抗體與標的蛋白間的專一性結合而靠近,此時以 680 nm 雷射光激發 Donor Bead,即可藉由能量轉移反應測得 Acceptor Bead 所發出的 520-620 nm 螢光訊號。

 

產品效能:

採用 AlphaScreen SureFire 偵測平台可得到量化的實驗結果,讓研究者能夠更清晰地辨識出實驗組 (CTL) 與對照組 (UV) 之間的磷酸化蛋白質表現差異程度。(A) Western blot; (B) AlphaScreen assay for JNK; (C) AlphaScreen SureFire assay for P-p38 and P-Erk2.
[Data source: Apoptosis. 2008 Mar/ 13(3):343-53.]

 

AlphaScreen SureFire 可適用在 Primary Cell 的磷酸化蛋白質偵測。以 AlphaScreen SureFire p70S6K Kit (Cat# PK-TGR70S500) 偵測 Primary Fibroblast Cell 中 phosphorylated p70S6K (Thr389) 的含量,左圖顯示 Rapamycin 對於 p70 S6 Kinase 磷酸化過程具有抑制效果。
[Data source: Cellular and Biochemical mTOR Assays for the Phosphorylation of p70 S6K in Oncology Research.]

 

AlphaScreen SureFire 不需 over-expression 就能直接測得細胞內原始的磷酸化蛋白質含量。以未經刺激活化過的 HUVEC 細胞作為研究對象,並以不同濃度的 U0126 抑制劑 (MEK inhibitor, Calbiochem) 或 LY294002 抑制劑 (PI3K inhibitor, Calbiochem) 分別投與 HUVEC 細胞培養皿中作用,接著以 AlphaScreen SureFire phospho-ERK Assay Kit (Cat# PK-TGRES500) 來偵測 HUVEC 細胞內的磷酸化 ERK1/2 含量。左圖為進行三重複實驗後所得到的實驗結果。結果顯示相較於用來作為對照組的非 MAPK pathway 抑制劑 LY2940022 (▲),U0126 抑制劑 (●) 的確可專一性地抑制 MEK 磷酸化 ERK1/2 的反應,且其抑制活性 IC50: 100 nM 與 1998 年 Duncia et al. 研究團隊發表於 Bioorg Med Chem Lett. 期刊的研究結果相似 (IC50: 70 nM for MEK 1; IC50 : 60 nM for MEK 2)。
[Data source: A Sensitive and Precise Tool for Measuring Endogenous Kinase Activity in Primary Cells — AlphaScreen SureFire.]

 

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