PROTACs 藥物開發工具:E3 Ligase Binding Assay Kits | PerkinElmer Cisbio

💊 PROTACs 藥物開發工具

E3 Ligase Binding Assay Kits

巧妙的 PROTACs 藥物作用原理(圖 1) 泛素-蛋白酶體系統 (ubiquitin-proteasome system, UPS) 是真核生物維持細胞內蛋白質恆定 (protein homeostasis) 的一個重要機制,用來消除錯誤折疊、損壞和磨損的蛋白質。在此機制中,有待被分解回收的蛋白質會在 E1、E2、E3 三種酵素的順序作用下連接上泛素 (ubiquitin),使其能被 26S 蛋白酶體 (26S proteasome) 辨識與降解 [1-3]。在泛素化 (ubiquitination) 過程中,E3 連接酶 (E3 ligase) 肩負著辨識目標蛋白質以及將 E2 酵素所攜帶的泛素轉移銜接至目標蛋白質的重要功能。蛋白水解靶向嵌合體 (proteolysis targeting chimeras, PROTACs) 藥物的設計原理即是透過兩個分別能夠和 E3 連接酶以及目標蛋白質 (protein of interest, POI) 結合的配體 (ligands),使 E3 連接酶得以靠近目標蛋白質並將其標記上泛素,如此一來就能巧妙地利用細胞本身的 UPS 機制消除掉特定的疾病相關蛋白質,達到治療效果 [1, 3-5]。

PROTACs 藥物作用原理示意圖

圖 1﹑PROTACs 藥物作用原理示意圖。 IMAGE © Cancers (Basel). 2021 Jun 20;13(12):3079 [1].

尋找更多可用的 E3 連接酶與配體,以擴展 PROTACs 藥物的多元性與有效性 自從 Sakamoto 等人在 2001 年首度證實 PROTACs 藥物概念的可行性後,迅速地在癌症、自體免疫疾病、神經退化性疾病與病毒傳染病等多種疾病治療領域蓬勃發展。例如由 PROTACs 技術巨擘 Craig Crews 教授所創立的生技公司 Arvinas,目前就有兩種口服型 PROTAC 藥物進入臨床二期,分別是用於治療荷爾蒙療法治療失效後的轉移性攝護腺癌 (metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC) 的 “ARV-110”,以及用於治療 ER+/HER2- 轉移性乳癌的 “ARV-471”,對 PROTACs 藥物研發界來說極具指標意義 [6, 7]。值得一提的是,目前絕大部分開發中的 PROTACs 藥物都是以 Cereblon (CRBN) 或 Von Hippel-Lindau (VHL) 這兩種 E3 連接酶作為藥物設計基礎,然而人體中其實有超過 600 種以上的 E3 連接酶,尋找更多可用的 E3 連接酶與配體,將有助於擴展 PROTACs 藥物的多元性與有效性,甚至研製出能夠專一性作用於特定組織或細胞的 PROTACs 藥物 [1, 4, 6, 8]。

PerkinElmer 公司旗下 Cisbio 研發團隊以專利 HTRF® 技術開發出多款 E3 Ligase Binding Assay Kits,包含 CRBNcIAP1 (BIR2 domain)cIAP1 (BIR3 domain)MDM2,具有簡易的全均質化實驗流程以及靈敏穩定的偵測效能,能夠幫助您精確快速地完成 E3 連接酶結合配體的高通量篩選 (high throughput screening, HTS),提高 PROTACs 藥物研發效率!以下為您介紹 HTRF E3 Ligase Binding Assays 的檢測原理、實驗流程、產品效能與訂購資訊。

以 HTRF 技術快速篩選出 E3 連接酶的結合配體 (E3 ligase ligands)

HTRF E3 Ligase Binding Assays 檢測原理(圖 2) 以 HTRF MDM2 Binding Kit 為例,GST 標定的人類 MDM2 蛋白質會被標定有供體螢光 Eu cryptate 的 GST 專一性抗體 (Anti-GST Eu3+ antibody) 所辨識,並與標定有受體螢光 Red 的配體 MI-1061 (MI-1061-Red) 結合,使供體螢光與受體螢光間的距離得以拉近。在 317 nm 光源激發下,供體螢光所發出的能量 (620 nm) 將可轉移至鄰近的受體螢光,激發其產生 665 nm 螢光訊號。若待測藥物能夠與 MDM2 結合,就會與 MI-1061-Red 產生競爭,造成 HTRF 訊號下降,最終可藉由 Ki 數值判斷藥物的結合能力,篩選出候選藥物進行後續確效試驗。

HTRF HTRF MDM2 Binding Kit 檢測原理示意圖

圖 2﹑HTRF HTRF MDM2 Binding Kit 檢測原理示意圖。

實驗流程(圖 3) 以 HTRF MDM2 Binding Kit 為例,僅需在 96-well 或 384-well 微量多孔盤孔洞中依序加入待測藥物(或標準品)、GST 標定的人類 MDM2 蛋白質、以及 HTRF 偵測混合液 (Anti-GST Eu3+ antibody + MI-1061-Red),於室溫下靜置反應 1 小時後即可進行訊號偵測。訊號可穩定維持 48 小時,讓實驗排程更彈性便利。

HTRF MDM2 Binding Kit 實驗流程示意圖

圖 3﹑HTRF MDM2 Binding Kit 實驗流程示意圖。

產品效能(圖 4) 使用 HTRF MDM2 Binding Kit 檢測四種藥物,其中以 AMG-232 表現出最佳的 MDM2 結合能力,其次為 Nutlin-3a 與 MI-773;Lenalidomide 則是已知的 CRBN 配體,完全不會與 MDM2 結合。此實驗結果與過去的文獻報導相符,顯示 HTRF E3 Ligase Binding Assay Kits 的確能夠精確地檢測出各種藥物對特定 E3 Ligase 的結合能力差異。

HTRF MDM2 Binding Kit 產品效能

圖 4﹑HTRF MDM2 Binding Kit 產品效能。

產品訂購資訊

HTRF E3 Ligase Binding Assay Kits

Product Name Pack Size Cat. No.
Cereblon binding kit 500 tests 64BDCRBNPEG
10000 tests 64BDCRBNPEH
HTRF cIAP1 BIR2 Binding Kit 500 tests 64BDIAPB2PEG
10000 tests 64BDIAPB2PEH
HTRF cIAP1 BIR3 Binding Kit 500 tests 64BDIAPB3PEG
10000 tests 64BDIAPB3PEH
HTRF MDM2 Binding Kit 500 tests 64BDMDM2PEG
10000 tests 64BDMDM2PEH

HTRF PROTAC Binding Assay Kits

Product Name POI E3 Pack Size Cat. No.
BCL-XL/CRBN PROTAC Binding Assay Kit BCL-XL CRBN 500 tests 63ADK000CB37PEG
10000 tests 63ADK000CB37PEH
BCL-XL/VHL PROTAC Binding Assay Kit BCL-XL VHL 500 tests 63ADK000CB38PEG
10000 tests 63ADK000CB38PEH
BRD4/CRBN PROTAC Binding Assay Kit BRD4 CRBN 500 tests 63ADK000CB31PEG
10000 tests 63ADK000CB31PEH
BRD4/VHL PROTAC Binding Assay Kit BRD4 VHL 500 tests 63ADK000CB32PEG
10000 tests 63ADK000CB32PEH
KRAS-G12C/VHL PROTAC Binding Assay Kit KRAS-G12C VHL 500 tests 63ADK000CB30PEG
10000 tests 63ADK000CB30PEH

近期將陸續新增更多 E3 Ligase 與 PROTACs 研究試劑,完整產品資訊與技術支援服務,歡迎洽詢 PerkinElmer Cisbio 台灣代理 — 伯森生技。也非常歡迎隨時找我們一同交流討論 PROTACs 藥物研發與高通量篩選的各種疑難雜症與實驗問題喔~(👨‍💻伯森生技線上線下聯絡資訊

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References

  1. LaPlante G, Zhang W. Targeting the Ubiquitin-Proteasome System for Cancer Therapeutics by Small-Molecule Inhibitors. Cancers (Basel). 2021 Jun 20;13(12):3079. PMID: 34203106
  2. Gong B, et al. The Ubiquitin-Proteasome System: Potential Therapeutic Targets for Alzheimer's Disease and Spinal Cord Injury. Front Mol Neurosci. 2016 Jan 26;9:4. PMID: 26858599
  3. Bricelj A, et al. E3 Ligase Ligands in Successful PROTACs: An Overview of Syntheses and Linker Attachment Points. Front Chem. 2021 Jul 5;9:707317. PMID: 34291038
  4. Ishida T, Ciulli A. E3 Ligase Ligands for PROTACs: How They Were Found and How to Discover New Ones. SLAS Discov. 2021 Apr;26(4):484-502. PMID: 33143537
  5. PROTAC® Degraders. Arvinas, Inc.
  6. He M, Lv W, Rao Y. Opportunities and Challenges of Small Molecule Induced Targeted Protein Degradation. Front Cell Dev Biol. 2021 Jun 22;9:685106. PMID: 34249939
  7. Pipeline. Arvinas, Inc.
  8. Cecchini C, et al. From Conception to Development: Investigating PROTACs Features for Improved Cell Permeability and Successful Protein Degradation. Front Chem. 2021 Apr 20;9:672267. PMID: 33959589
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