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💊 PROTACs 藥物開發工具 E3 Ligase Binding Assay Kits 巧妙的 PROTACs 藥物作用原理（圖 1） 泛素-蛋白酶體系統 (ubiquitin-proteasome system, UPS) 是真核生物維持細胞內蛋白質恆定 (protein homeostasis) 的一個重要機制，用來消除錯誤折疊、損壞和磨損的蛋白質。在此機制中，有待被分解回收的蛋白質會在 E1、E2、E3 三種酵素的順序作用下連接上泛素 (ubiquitin)，使其能被 26S 蛋白酶體 (26S proteasome) 辨識與降解 [1-3]。在泛素化 (ubiquitination) 過程中，E3 連接酶 (E3 ligase) 肩負著辨識目標蛋白質以及將 E2 酵素所攜帶的泛素轉移銜接至目標蛋白質的重要功能。蛋白水解靶向嵌合體 (proteolysis targeting chimeras, PROTACs) 藥物的設計原理即是透過兩個分別能夠和 E3 連接酶以及目標蛋白質 (protein of interest, POI) 結合的配體 (ligands)，使 E3 連接酶得以靠近目標蛋白質並將其標記上泛素，如此一來就能巧妙地利用細胞本身的 UPS 機制消除掉特定的疾病相關蛋白質，達到治療效果 [1, 3-5]。
圖 1﹑PROTACs 藥物作用原理示意圖。 IMAGE © Cancers (Basel). 2021 Jun 20;13(12):3079 [1]. 尋找更多可用的 E3 連接酶與配體，以擴展 PROTACs 藥物的多元性與有效性 自從 Sakamoto 等人在 2001 年首度證實 PROTACs 藥物概念的可行性後，迅速地在癌症、自體免疫疾病、神經退化性疾病與病毒傳染病等多種疾病治療領域蓬勃發展。例如由 PROTACs 技術巨擘 Craig Crews 教授所創立的生技公司 Arvinas，目前就有兩種口服型 PROTAC 藥物進入臨床二期，分別是用於治療荷爾蒙療法治療失效後的轉移性攝護腺癌 (metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC) 的 “ARV-110”，以及用於治療 ER+/HER2- 轉移性乳癌的 “ARV-471”，對 PROTACs 藥物研發界來說極具指標意義 [6, 7]。值得一提的是，目前絕大部分開發中的 PROTACs 藥物都是以 Cereblon (CRBN) 或 Von Hippel-Lindau (VHL) 這兩種 E3 連接酶作為藥物設計基礎，然而人體中其實有超過 600 種以上的 E3 連接酶，尋找更多可用的 E3 連接酶與配體，將有助於擴展 PROTACs 藥物的多元性與有效性，甚至研製出能夠專一性作用於特定組織或細胞的 PROTACs 藥物 [1, 4, 6, 8]。
HTRF E3 Ligase Binding Assays 檢測原理（圖 2） 以 HTRF MDM2 Binding Kit 為例，GST 標定的人類 MDM2 蛋白質會被標定有供體螢光 Eu cryptate 的 GST 專一性抗體 (Anti-GST Eu3+ antibody) 所辨識，並與標定有受體螢光 Red 的配體 MI-1061 (MI-1061-Red) 結合，使供體螢光與受體螢光間的距離得以拉近。在 317 nm 光源激發下，供體螢光所發出的能量 (620 nm) 將可轉移至鄰近的受體螢光，激發其產生 665 nm 螢光訊號。若待測藥物能夠與 MDM2 結合，就會與 MI-1061-Red 產生競爭，造成 HTRF 訊號下降，最終可藉由 Ki 數值判斷藥物的結合能力，篩選出候選藥物進行後續確效試驗。
圖 2﹑HTRF HTRF MDM2 Binding Kit 檢測原理示意圖。 實驗流程（圖 3） 以 HTRF MDM2 Binding Kit 為例，僅需在 96-well 或 384-well 微量多孔盤孔洞中依序加入待測藥物（或標準品）、GST 標定的人類 MDM2 蛋白質、以及 HTRF 偵測混合液 (Anti-GST Eu3+ antibody + MI-1061-Red)，於室溫下靜置反應 1 小時後即可進行訊號偵測。訊號可穩定維持 48 小時，讓實驗排程更彈性便利。
圖 3﹑HTRF MDM2 Binding Kit 實驗流程示意圖。 產品效能（圖 4） 使用 HTRF MDM2 Binding Kit 檢測四種藥物，其中以 AMG-232 表現出最佳的 MDM2 結合能力，其次為 Nutlin-3a 與 MI-773；Lenalidomide 則是已知的 CRBN 配體，完全不會與 MDM2 結合。此實驗結果與過去的文獻報導相符，顯示 HTRF E3 Ligase Binding Assay Kits 的確能夠精確地檢測出各種藥物對特定 E3 Ligase 的結合能力差異。
圖 4﹑HTRF MDM2 Binding Kit 產品效能。
HTRF E3 Ligase Binding Assay Kits
HTRF PROTAC Binding Assay Kits
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