📑 真實案例分享

以 HiFi 定序提高罕見疾病的診斷率

根據衛生福利部國民健康署公告，國內對於罕見疾病的認定標準是盛行率小於萬分之一的先天性疾病 [1]，目前國內有超過 1.8 萬個罕見疾病患者 [2]，全球罕見疾病人口總數更已突破 3 億 [3]，顯示罕見疾病其實並不真的那麼“罕見”，可能正影響著你我或身旁許許多多的家庭。臨床上有多種基因檢測技術可以用來進行遺傳疾病與罕見疾病診斷（圖 1），然而即使是目前認定最為精準的 NGS 次世代定序技術，仍僅有不到 50% 的診斷率 [4-6]。

圖 1﹑隨著基因檢測技術可檢測出的基因變異種類增加，診斷率也隨之提升。 IMAGE © PacBio [6].

侷限 NGS 技術診斷效率的主要因素，一是因為 NGS 技術無法有效觸及重複序列區域，因此遺失了許多疾病相關的重要序列資訊，二是因為 NGS 技術的定序片段長度僅有 100-350 bp，對於較長範圍的基因體結構變異 (structural variants, SVs) 往往覆蓋率不佳，這些限制都造成 NGS 技術無法全面性地檢測到所有類型的基因變異，最終導致診斷陷入困難與瓶頸 [6, 7]。

為了幫助患者找出確切病因，目前已有多個知名醫療院所與研究單位正採用 HiFi 定序進行罕見疾病診斷與相關研究，包含美國堪薩斯城兒童慈善醫院研究中心 (Children’s Mercy Research Institute) 和 Microsoft、PacBio 共同合作的兒童基因體答案計畫 “Genomic Answers for Kids (GA4K)”、美國國衛院臨床定序研究計畫 (Clinical Sequencing Evidence-Generating Research, CSER) 的兒童智能障礙與發育遲緩研究子計畫、歐盟贊助支持的罕見疾病研究計畫 “SOLVE-RD” 等等。

HiFi 定序是基於 PacBio 公司獨家 SMRT 單一分子即時定序技術 (Single Molecule, Real-Time Sequencing) 所開發出的高精準度長讀取定序技術 (highly accurate long-read sequencing)，兼具有長達 10-25 kb 的序列讀取長度，與 >99.9% 比肩 NGS 技術的高準確度。根據最新一屆 precisionFDA 真實挑戰賽競賽結果以及瓶中基因體 (Genome in a Bottle, GIAB) 聯盟最新發表的結構變異基準文獻，證實 HiFi 定序能夠精準檢測各種類型的基因序列變異，包含：單核苷酸變異 (SNVs)、插入缺失變異 (Indels) 與結構變異 (SVs)，為當前最佳定序技術，具有最優異的準確度與解析度（圖 3） [8]。

圖 3﹑HiFi 定序能夠精準檢測各種類型的基因序列變異，為當前最佳定序技術，具有最優異的準確度與解析度。 IMAGE © PacBio Webinar. Time: 08:32 [8]

今年五月端粒到端粒聯盟 (Telomere to Telomere Consortium) 以 HiFi 定序數據作為基礎，完成了史上第一個完整的人類基因體序列 “CHM13v1.1”，他們的研究成果再次驗證了 HiFi 定序對於重複序列區域的極佳解析能力，以及 HiFi 定序數據的高度準確性！PacBio 科技總監 Jonas Korlach 博士在近期一場罕見疾病專題演講中，分享了許多 NGS 技術無法診斷、卻以 HiFi 定序技術成功找出病因的實際案例，以下為您簡單介紹其中兩個案例。

美國 HudsonAlpha 生物技術研究所近期發表了一篇有關 PacBio HiFi 定序技術有助於神經發育障礙診斷的論文，他們從 6 組 NGS 技術無法檢測出病因的患病兒童與其父母的 HiFi 定序資訊中，成功鑑定找出其中兩位患者的病因，一位是基因體中帶有一段長達近 7 kb 的插入序列變異，此變異會造成 CDKL5 基因的功能喪失；而另一位病患的基因體則是帶有多個大片段結構變異，將影響至少 7 個基因的蛋白質表現。值得一提的是，由於 HiFi 定序數據兼具有長讀取與高準確度，因此可以藉由序列的單核苷酸變異特徵進行單倍體定相分析 (haplotype phasing)。作者們即藉由 HiFi 數據，發現 CDKL5 基因的插入序列變異是發生在病患父源染色體上的新生變異 (de novo variation) [8, 9]。

IMAGE © PacBio Webinar. Time: 11:39 [8]

美國堪薩斯城兒童慈善醫院基因醫學中心實驗室主持人 Emily Farrow 博士在近期一場線上演講中分享了許多 HiFi 定序成功鑑定找出病因的案例，其中一個案例是在一個家族中有多個不同世代成員都出現嚴重程度不一的肌張力不全 (dystonia)、癲癇發作 (seizures)、運動失調 (ataxia) 等症狀，然而無論是 Microarray 或 NGS 技術都找不出病因，因此無法進行診斷。最終他們透過 HiFi 定序，發現所有患病成員 STARD7 基因的第一個內含子 (intron) 中都會出現重複序列插入變異，因此得以診斷他們所罹患的是家族性成年型肌陣攣性癲癇 (OMIM# 607876) [8, 10]。

IMAGE © PacBio Webinar. Time: 13:23 [8]

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您可透過下方連結瀏覽更多相關資訊：

• Variant detection using whole genome sequencing with HiFi reads – Best Practices
• 《Genomics》期刊論文選讀：以 HiFi 定序技術破解全外顯子定序未能檢測出的併發症型智能障礙基因變異
• PacBio HiFi 定序（中文字幕動畫短片）
• 關於 Pacific Biosciences (PacBio)

References

1. 衛生福利部罕見疾病及藥物審議會第 62 次會議紀錄
2. 110 年 6 月罕見疾病通報個案統計表
3. What is a Rare Disease? Rare Diseases International
4. Gilissen C, et al. Genome sequencing identifies major causes of severe intellectual disability. Nature. 2014 Jul 17;511(7509):344-7. PMID: 24896178
5. Mitsuhashi S, Matsumoto N. Long-read sequencing for rare human genetic diseases. J Hum Genet. 2020 Jan;65(1):11-19. PMID: 31558760
6. Whole genome sequencing for understanding rare diseases. PacBio Informational Guide
7. Logsdon GA, Vollger MR, Eichler EE. Long-read human genome sequencing and its applications. Nat Rev Genet. 2020 Oct;21(10):597-614. PMID: 32504078
8. Increasing the Solve Rate of Rare and Undiagnosed Genetic Diseases with HiFi Sequencing. Jonas Korlach, Chief Scientific Officer at PacBio. 2021 Mar 10. PacBio Webinar
9. Hiatt SM, et al. Long-read genome sequencing for the molecular diagnosis of neurodevelopmental disorders. HGG Adv. 2021 Apr 8;2(2):100023. PMID: 33937879
10. Applications of Third Generation Sequencing in Unsolved Disease. Emily Farrow, Director of Laboratory Operations, Genomic Medicine Center at Children’s Mercy Kansas City. 2020 Oct 28. PacBio Webinar