JAK2, STAT3 Western Blot 實戰技巧

JAK2, STAT3 Western Blot 實戰技巧

JAK-STAT 訊息傳遞路徑的異常活化與多種自體免疫疾病和癌症相關，其中 JAK2 與 STAT3 更是癌症新藥開發領域的熱門標靶。以下我們整理了這兩個蛋白質在進行 Western Blot (WB) 檢測時所需注意的實驗關鍵點，期望能幫助您更快取得優質的檢測結果！

JAK2 的 Western Blot 檢測注意事項

JAK2 蛋白在人類、小鼠和大鼠中具有相似的分子量 (130 kDa)，在大部分的組織中皆有表現。進行 JAK2 蛋白的 WB 檢測時，可以選用 A549、Jurkat、K562、NIH 3T3 等細胞株的細胞溶解物 (cell lysates) 作為陽性對照，並以 JAK2 基因剔除細胞的細胞溶解物作為陰性對照。若要檢測磷酸化的 JAK2 蛋白，可以依照細胞本身特性在必要時使用 Pervanadate 處理細胞，刺激細胞內 JAK2 的磷酸化反應增加，使 Phospho JAK2 (Y1007 + Y1008) 更容易被檢測得到。

圖 1﹑JAK2 蛋白質 WB 檢測（點圖看詳細說明）。綠色條帶為 JAK2，紅色條帶為 GAPDH。🧪 實驗材料：〈一級抗體〉Anti-JAK2 antibody [EPR108(2)] (ab108596)、Anti-GAPDH antibody [6C5] (ab8245)；〈Lane 1 樣本〉野生型 (wild-type) A549 細胞株的細胞溶解物；〈Lane 2 樣本〉JAK2 基因剔除 A549 細胞株的細胞溶解物 (ab256963)；〈Lane 3 樣本〉K562 細胞株的細胞溶解物；〈Lane 4 樣本〉Daudi 細胞株的細胞溶解物。

圖 2﹑磷酸化 JAK2 蛋白質 WB 檢測（點圖看詳細說明）。🧪 實驗材料：〈一級抗體〉Anti-JAK2 (phospho Y1007 + Y1008) antibody [E132] (ab32101)、Anti-JAK2 antibody [EPR108(2)] (ab108596)、Anti-GAPDH antibody [EPR16891] (ab181602)；〈Lane 1 樣本〉Jurkat 細胞株的細胞溶解物；〈Lane 2 樣本〉Jurkat 細胞株經過 Pervanadate (50 mM, 5 分鐘) 處理後的細胞溶解物；〈Lane 3 樣本〉Lane 2 樣本在經過電泳、轉漬後，先將轉漬膜與鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase, AP) 反應後再進行檢測。

其他需要注意的實驗細節還包括：

樣本製備

務必記得要在裂解緩衝液 (lysis buffer) 中添加蛋白酶抑制劑混合物 (Protease Inhibitor Cocktails) 以避免 JAK2 蛋白質降解；若要檢測的是磷酸化 JAK2，還必須再額外添加磷酸酶抑制劑混合物 (Phosphatase Inhibitor Cocktails)，或者也可以直接選用蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑混合物 (Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails)。
整個樣本製備過程中，保持樣本置於冰上。

電泳

建議使用 8% 濃度的分離膠體進行電泳。

轉漬

於轉漬緩衝液中添加 SDS（終濃度 0.1%），並將緩衝液中的甲醇濃度控制在 10% 以下。
建議使用 0.45 μm 孔徑的 PVDF 轉漬膜。
轉漬完成後使用麗春紅染劑 (Ponceau S Solution) 對轉漬膜進行染色，確認轉漬效率。

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STAT3 的 Western Blot 檢測注意事項

STAT3 蛋白在人類和小鼠中都會經由選擇性剪接 (alternative splicing) 產生三種轉錄異構物 (transcript isoforms)，所轉譯出的蛋白質異構物 (protein isoforms) 分子量約在 83-88 kDa 左右。進行 STAT3 蛋白的 WB 檢測時，可以選用 HeLa、HepG2、Jurkat、K562、NIH 3T3 或 PC-12 等細胞溶解物作為陽性對照，並以 STAT3 基因剔除細胞溶解物作為陰性對照。若要檢測磷酸化的 STAT3 蛋白，可以依照細胞本身特性在必要時使用 EGF、Interferon alpha (IFN-α) 或 IL6 等細胞激素處理細胞，以活化 JAK/STAT3 訊息傳遞路徑，使 Phospho STAT3 (Y705) 或 Phospho STAT3 (S727) 更容易被檢測得到。

圖 3﹑STAT3 蛋白質 WB 檢測（點圖看詳細說明）。綠色條帶為 STAT3，紅色條帶為 GAPDH。🧪 實驗材料：〈一級抗體〉Anti-STAT3 antibody [EPR787Y] (ab68153)、Anti-GAPDH antibody [6C5] (ab8245)；〈Lane 1 樣本〉野生型 HeLa 細胞株的細胞溶解物；〈Lane 2 樣本〉STAT3 基因剔除 HeLa 細胞株的細胞溶解物 (ab263797)。

圖 4﹑磷酸化 STAT3 蛋白質 WB 檢測（點圖看詳細說明）。🧪 實驗材料：〈一級抗體〉Anti-STAT3 (phospho Y705) antibody [EPR23968-52] (ab267373)、Anti-STAT3 antibody [EPR787Y] (ab68153)；〈Lane 1 樣本〉HepG2 細胞株經過血清飢餓 (serum-starved) 培養一晚後的細胞溶解物；〈Lane 2 樣本〉HepG2 細胞株經過血清飢餓培養一晚，再添加 IL-6 (100 ng/ml) 刺激處理 30 分鐘後的細胞溶解物。

其他需要注意的實驗細節大致上與前文 JAK2 描述相同，除了以下兩點：

電泳

建議使用 10% 濃度的分離膠體進行電泳。

轉漬

轉漬緩衝液中建議含 20% 甲醇，且不需額外添加 SDS。

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