Western Blot 實驗做不出來?讓 Abcam Checklist 協助你一一排除問題

Western Blot 實驗做不出來?讓 Abcam Checklist 協助你一一排除問題

西方墨點法 (Western Blot, 以下簡稱 WB) 是最常使用的實驗技術之一,實驗流程主要包含樣本製備 (Sample Preparation)、電泳分離 (Electrophoresis)、轉漬 (Transfer)、阻斷 (Blocking)、抗體反應 (Antibody Incubation) 與訊號偵測 (Signal Detection)。這六大步驟環環相扣,稍有疏忽就可能導致實驗結果不佳,甚至一無所獲。為了協助您能取得良好的 WB 實驗結果,Abcam 特別提供便捷的【Western Blot 實驗檢查清單】供您下載使用。清單中列出 WB 每個實驗步驟需要特別注意的實驗細節、操作條件,透過這份清單您可以檢視是否遺漏了哪些關鍵點。或者,您也可以透過以下內容了解 WB的實驗注意事項。

Western Blot Flow Chart

1. 樣本製備 (Sample Preparation)

1.1 了解目標蛋白,選擇正確的樣本。在實驗開始前,請務必透徹了解目標蛋白質的特性,例如:會在哪些組織或細胞中表現?是在細胞膜、細胞質還是細胞核中?是否表現量低微,需要誘導 (induction) 才能偵測得到?是否具有轉譯後修飾 (post-translational modification, PTM)?是否存在有其他異構物 (isoforms)?是否會形成二聚體 (dimer) 或多聚體 (polymer) 等四級結構?以及是否特別不穩定,容易降解?

當您充分掌握目標蛋白質的資訊,便能選擇正確的樣本、制定適合的樣本製備方案、合理解讀實驗結果。以下為您列舉出三個典型案例:

MMP9 蛋白質在各種不同細胞株中的表現量差異懸殊。 🧪 實驗材料:〈一級抗體〉Anti-MMP9 antibody [EP1255Y] (ab137867);〈Lane 1 樣本〉LoVo;〈Lane 2 樣本〉Huh7;〈Lane 3 樣本〉MCF7;〈Lane 4 樣本〉HeLa;〈Lane 5 樣本〉Caco-2;〈Lane 6 樣本〉A549, serum starved overnight;〈Lane 7 樣本〉A549, serum starved overnight, then treated with 80nM TPA for 24 hours;〈Lane 8 樣本〉MDA-MB-231, serum starved overnight;〈Lane 9 樣本〉MDA-MB-231, serum starved overnight, then treated with 200nM TPA for 24 hours;〈Lane 10 樣本〉HepG2。

HIF-1 alpha 蛋白質在大鼠神經膠質瘤細胞中需經過低氧誘導才表達。 🧪 實驗材料:〈一級抗體〉Anti-HIF-1 alpha antibody [EPR16897] (ab179483);〈Lane 1 樣本〉Untreated C6 (rat glial tumor glial cell);〈Lane 2 樣本〉C6 treated with 400 µM CoCl₂ and 20 µM MG-132 (ab141003) for 4 hours。

SQSTM1 / p62 蛋白質預期分子量為 47 kDa,但由於轉譯後修飾,最終 WB 實驗偵測到的條帶分子量為 62 kDa。 🧪 實驗材料:〈一級抗體〉Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR18351] (ab207305);〈Lane 1 樣本〉HepG2;〈Lane 2 樣本〉HeLa。

1.2 樣本製備注意事項。樣本製備是 WB 實驗的開端,裂解緩衝液 (lysis buffer) 的選擇、樣本的裂解方式與溫度等變性條件的控制,都會影響到樣本製備的成功與否。以下是 Abcam 團隊根據多年經驗所整理出的樣本製備注意事項,包含:

使用超音波破碎處理 THP-1 細胞後,可以富集到更多的 Histone H3 蛋白質。 🧪 實驗材料:〈一級抗體〉Anti-Histone H3 antibody [EPR16987] (ab176842)、Anti-GAPDH antibody [EPR16891] (ab181602);〈Lane 1 樣本〉使用超音波破碎處理過的 THP-1 細胞裂解液;〈Lane 2 樣本〉未經過超音波破碎處理的 THP-1 細胞裂解液。

  • 整個樣本製備過程中,保持樣本置於冰上。
  • 使用 Bradford assayBCA assay 或 Lowry assay 測定樣本蛋白質濃度。

2. 電泳分離 (Electrophoresis)

2.1 選用合適的蛋白質樣本變性 (Denature) 條件。一般實驗流程是使用 95°C 加熱或煮沸 5 分鐘,使蛋白質變性。然而對於有些多重跨膜蛋白 (multipass transmembrane proteins),建議使用 37℃ 或 70℃ 加熱 10 分鐘,能達到更好的蛋白質變性效果。

2.2 選用合適的電泳膠體濃度。電泳膠體的濃度,對於不同分子量的蛋白質具有不同的分離效果。您可參照下表,根據目標蛋白質的分子量選擇適合的電泳膠體濃度。

Protein Size Gel Acrylamide Percentage
4–40 kDa 20%
12–45 kDa 15%
10–70 kDa 12.5%
15–100 kDa 10%
25–200 kDa 8%

2.3 確保蛋白質樣本上樣量 (Loading) 充足。上樣量會影響到實驗最終是否能檢測到有效訊號、取得良好的成果。建議每個膠體孔槽 (well) 中注入至少 20 μg 總蛋白 (total protein) 樣本進行電泳。

2.4 設立實驗對照組 (Control)。務必設立陽性對照組 (Positive Control)(可參閱抗體說明書上所標示的陽性對照樣本)與陰性對照組 (Negative Control)(例如使用不會表現目標蛋白的細胞作為陰性對照樣本,以排除偽陽性結果)。Abcam【Knockout Cell Lysates】系列產品即是非常便利的選擇,它是 CRISPR/Cas9 基因剔除癌細胞株的細胞裂解液,可作為 WB 陰性對照組使用;同時可依需求隨附 Wild-type Lysates,作為 WB 陽性對照組。

除此之外,建議偵測 Loading Controls 以校正 Well 與 Well 之間、膠片與膠片之間樣本量的誤差。選擇 Loading Controls 時,應選擇與目標蛋白質分子量不同(以避免偵測結果互相干擾)且能在樣本中連續穩定表達的蛋白質。您可參照下表選擇合適的 Loading Controls,或參閱【Loading Controls 抗體產品目錄】取得相關產品資訊。

Whole Cell Cytoskeleton Nuclear
Cofilin
(19 kDa)
Cyclophilin B
(24 kDa)
Cdk4
(34 kDa)
GAPDH
(37 kDa)
Actin
(42 kDa)
β-Actin
(42 kDa)
β-Tubulin
(49 kDa)
α-Tubulin
(50 kDa)
Vinculin
(124 kDa)
Cofilin
(19 kDa)
Actin
(42 kDa)
β-Actin
(42 kDa)
β-Tubulin
(49 kDa)
α-Tubulin
(50 kDa)
Histone H3
(15 kDa)
PCNA
(29 kDa)
TBP
(38 kDa)
YY1
(45 kDa)
HDAC1
(55 kDa)
Lamin B1
(66 kDa)
Membrane Mitochondrial
NaK ATPase
(113 kDa)
COX IV
(17 kDa)
VDAC1/Porin
(31 kDa)
HSP60
(60 kDa)

3. 轉漬 (Transfer)

3.1 依據目標蛋白分子量大小調整轉漬緩衝液的 SDS 與甲醇 (Methanol) 濃度。目標蛋白質分子量大於 100 kDa 時,建議於轉漬緩衝液中添加 SDS(終濃度 0.1%),並將甲醇濃度控制在 10% 以下,以提高轉漬效率。目標蛋白質分子量小於 100 kDa 時,建議轉漬緩衝液中含 20% 甲醇。

透過檢測 HeLa 細胞裂解液中的 DNA PKcs 表現量,觀察轉漬緩衝液中的甲醇含量對轉漬效率的影響。 🧪 實驗材料:〈一級抗體〉Anti-DNA PKcs antibody [Y393] (ab32566);〈Lane 1〉轉漬緩衝液中含 10% 甲醇;〈Lane 2〉轉漬緩衝液中含 20% 甲醇。

3.2 選用合適的 PVDF 轉漬膜。目標蛋白質分子量小於 10 kDa 時,建議使用 0.2 μm 孔徑的 PVDF 轉漬膜。若最終偵測訊號為螢光型式,建議選用低螢光背景值 PVDF 轉漬膜 (ab133411)。

3.3 操作細節。經過甲醇活化完成後的 PVDF 轉漬膜需充分清洗,避免甲醇殘留於表面。轉漬開始前,務必確認轉漬膜與膠體間平整無氣泡。

3.4 檢視轉漬效率。轉漬完成後建議可以使用【麗春紅染劑 (Ponceau S Solution)】對轉漬膜進行染色,以確認轉漬效率。 ⚠ 若最終偵測訊號為螢光型式,請於檢視完轉漬效率後確保轉漬膜上的麗春紅染劑被充分洗淨。

使用麗春紅染色判斷轉漬實驗是否成功。 🧪 實驗材料:〈麗春紅染劑〉Ponceau S Solution (ab270042);〈左圖〉轉漬成功;〈右圖〉轉漬失敗。

4. 阻斷 (Blocking)

沒有適用所有實驗的阻斷液 (blocking buffer)。阻斷液的阻斷效果,會因不同的實驗樣本、目標蛋白而產生差異。因此建議您先進行測試,以挑選出最適合您實驗的阻斷液。

透過檢測 MCF7 細胞裂解液中的 p27 KIP 1 表現量,可觀察到不同阻斷液的阻斷效果不同。 🧪 實驗材料:〈一級抗體〉Anti-p27 KIP 1 antibody [Y236] (ab32034);〈Lane 1〉阻斷液為 2% BSA;〈Lane 2〉阻斷液為 5% BSA;〈Lane 3〉阻斷液為 5% NFDM/TBST。

5. 抗體反應 (Antibody Incubation)

抗體反應通常包含一級抗體與二級抗體反應,一級抗體可專一性地辨識目標蛋白質,二級抗體則能辨識一級抗體,具有放大訊號的作用。在進行抗體反應時,Abcam 團隊會注意以下事項:

  • 避免轉漬膜處於乾燥狀態,同時避免裁剪轉漬膜。
  • 依照抗體說明書指示稀釋使用抗體。若抗體本身無任何使用指示,可以嘗試先從 1:100–1:3,000 測試一級抗體稀釋比例 ,二級抗體則是建議從 1:1,000–1:20,000 的範圍開始進行測試。
  • 使用新鮮配製的抗體,不建議抗體重複使用。
  • 抗體反應後,應充分沖洗轉漬膜,以減少非專一性結合反應。

6. 訊號偵測 (Signal Detection)

化學冷光訊號檢測注意事項:

  • ECL 冷光試劑配製時要避光,並且要現配現用。
  • ECL 冷光試劑用量要足夠,確保能夠均勻完整地覆蓋到整張轉漬膜。

螢光訊號檢測注意事項:

  • 溴酚藍 (Bromophenol blue) 染劑本身會發出螢光,務必讓它遠離目標條帶 (target band)。
  • 若要在轉漬膜上做標記,使用鉛筆而非原子筆。

更多 WB 技術資源

以上就是 Abcam 團隊在進行 WB 實驗時會特別關注的一些小細節。在您進行日常的 WB 實驗時,歡迎下載使用【Western Blot 實驗檢查清單】,方便您隨時檢查是否遺漏了哪些關鍵點!任何 WB 疑難雜症,也歡迎直接洽詢 Abcam 台灣代理 — 伯森生技,我們將針對您正遭遇的問題提供技術支援與建議。您可透過下方連結瀏覽更多 WB 技術資源與相關資訊:

伯森生物科技股份有限公司 前往 Abcam 官方網站

伯森生物科技(股)公司 Blossom Biotechnologies, Inc.
網址 www.blossombio.com 客服 0800-059668
[ 📝 線上留言諮詢 ] [ ☎ 伯森業務專員聯絡資訊 ]

加入伯森生技 Line 好友 (@blossom_biotech)  前往伯森生技 FB 粉絲專頁 (@blossombiotechnologies)