一次解答 Collagen Western Blot 實驗的五個常見問題

膠原蛋白 (Collagen) 是哺乳動物體內含量最為豐富的蛋白質，在人體中約佔蛋白質總量的 25% 以上 [1, 2]。近年來隨著腫瘤微環境 (tumor microenvironment, TME) 的重要性逐漸為人所知，已有越來越多研究報導指出，作為細胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 核心成分的膠原蛋白具有應用於癌症診斷與治療的開發潛力 [3–6]。

ELISA, Western Blot 與 IHC 是進行膠原蛋白研究時經常使用到的免疫偵測技術，過去我們曾經分享過〈膠原蛋白抗體的選擇和實驗注意事项〉，今天我們將會針對以下五個大家在進行膠原蛋白 Western Blot 實驗時最常提出的疑問進行解答。

1. 膠原蛋白容易降解，有什麼方法可以改善或避免嗎？
2. Collagen I 的預測分子量是 139 kDa，為什麼我測出來的條帶分子量卻很小？
3. 為什麼我按照膠原蛋白分子量大小裁膜後，結果卻測不到訊號？
4. 使用 Western Blot 檢測膠原蛋白時，有哪些地方需要特別注意的？
5. 有建議的膠原蛋白萃取方法嗎？

• 在 Western Blot 實驗進行前新鮮製備細胞溶解物 (cell lysates)，並使用新鮮配製的裂解緩衝液 (lysis buffer)，同時提高裂解緩衝液中蛋白酶抑制劑的濃度，以最大程度避免蛋白質降解。
• 膠原蛋白比其他蛋白質更不穩定，從萃取至檢測建議都在 4°C 或冰上進行。
• 膠原蛋白在酸性條件下可溶，因此酸性 pH 對於維持膠原蛋白的穩定度及可溶性非常重要。在鹼性 pH 下或膠原蛋白濃度太高時，膠原蛋白都會聚合形成凝膠，影響 Western Blot 實驗結果。

若是檢測到比預測值 139 kDa 還低的條帶，可能原因有兩個，一是樣本處理不當導致蛋白質降解，另一個原因則有可能是偵測到第一型膠原蛋白 (Collagen I ) 形成過程中，切割游離出來的小片段 (如圖 2 所示)。

由於膠原蛋白存在醣基化後轉譯修飾，以及由前膠原蛋白 (procollagen) 形成膠原蛋白過程中，包含前膠原蛋白本身以及後續陸續產生的各種不同大小切割片段，這些都有可能導致測得的條帶比預期分子量更大 (如圖 3 所示)，甚至出現多條條帶的現象 (如文獻 PMID: 23940311, Fig. 1B)。因此若是僅按照預測分子量裁切轉漬膜，就很有可能丟失蛋白質訊號。建議在進行膠原蛋白 Western Blot 檢測時不要裁膜，保留整張膜進行後續偵測步驟。

• 注意實驗試劑的 pH 值、溫度和膠原蛋白濃度，避免膠原蛋白形成凝膠。
• 在樣本中添加 4M Urea、清潔劑 (detergents)、還原劑和變性劑 (chaotropic agents) 可以改善電泳過程中膠原蛋白的分離效果。
• 使用合適濃度的電泳分離膠體，例如：Collagen I、II、III 建議使用 6% gel，Collagen IV、V、VI 則建議使用 10% gel，或者也可以直接選擇使用梯度膠體。

除此之外，請查看您手邊使用的膠原蛋白抗體是屬於哪一種？如果使用的膠原蛋白抗體是通過短胜肽序列免疫製成的，例如 ab138492, ab184993, ab214417 等這類 RabMAb® 系列重組兔單株抗體，基本上可以依照一般 Western Blot 實驗進行即可。說到這裡順便跟大家插播一個便利小工具〈Western Blot 實驗檢查清單〉，它可以方便你在整個 Western Blot 實驗過程中隨時對照查看步驟中的關鍵要點，避免疏失和踩雷！下次做 Western Blot 實驗時不妨試用看看喔。

言歸正傳，如果您使用的是辨識膠原蛋白天然三維構形的抗體 (例如 ab34710, ab7778, ab6586...)，就要特別注意防止膠原蛋白變性以免影響抗體辨識效果，並遵循：(1) Western Blot 實驗全程在 10°C 以下完成；(2) 使用 native PAGE 進行電泳；(3) 使用天然膠原蛋白作為實驗對照組。

除了以上常規注意事項，實際上仍有可能需要依照樣本特性、實驗設計與不同膠原蛋白特質，對 Western Blot 實驗條件進行個別化的調整。例如下方圖 4 即是我們的客戶與我們分享的他的實驗優化結果。

常用的膠原蛋白萃取方法有三種，萃取效率最佳的是酵素法、其次是酸萃取法、最後是鹽沉澱法 (如圖 5 所示)。Abcam 推薦使用通過胃蛋白酶 (Pepsin) 萃取膠原蛋白的酵素法，因為它能去除膠原蛋白結構中的非螺旋末端，提高膠原蛋白溶解度，進而提升萃取效率。

酵素法基本上是將膠原纖維組織碎片加入含有 5mM EDTA、0.1% (w/v) 胃蛋白酶的 0.5M 醋酸溶液 (pH 2.5–3)，於 4°C 均勻攪拌混合 48–96 小時，再經由離心、沉澱、透析等步驟，最終萃取出可溶性的膠原蛋白 [7]。要特行提醒的是，為避免膠原蛋白降解變性，整個萃取流程均需在 4°C 進行；並且胃蛋白酶的用量會因不同組織而不同，需小心斟酌測試用量。

若您對以上內容有任何疑問，或需要我們提供進一步技術支援服務，歡迎洽詢 Abcam 台灣代理伯森生技。同時也非常歡迎各位科研小夥伴們與我們交流分享您的膠原蛋白實驗經驗與心得喔！您可透過下方連結瀏覽更多相關資訊：

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References

1. Ricard-Blum S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Jan 1;3(1):a004978. PMID: 21421911
2. Andriotis OG, Nalbach M, Thurner PJ. Mechanics of isolated individual collagen fibrils. Acta Biomater. 2022 Dec 10:S1742-7061(22)00811-X. PMID: 36509398
3. Necula L, et al. Collagen Family as Promising Biomarkers and Therapeutic Targets in Cancer. Int J Mol Sci. 2022 Oct 17;23(20):12415. PMID: 36293285
4. Baldari S, et al. Strategies for Efficient Targeting of Tumor Collagen for Cancer Therapy. Cancers (Basel). 2022 Sep 27;14(19):4706. PMID: 36230627
5. Song K, et al. Collagen Remodeling along Cancer Progression Providing a Novel Opportunity for Cancer Diagnosis and Treatment. Int J Mol Sci. 2022 Sep 10;23(18):10509. PMID: 36142424
6. Papanicolaou M, et al. Temporal profiling of the breast tumour microenvironment reveals collagen XII as a driver of metastasis. Nat Commun. 2022 Aug 6;13(1):4587. doi: 10.1038/s41467-022-32255-7. PMID: 35933466
7. Mocan E, Tagadiuc O, Nacu V. Aspects of collagen isolation procedure. Clinical Research Studies. 2011 2(320):3.