從《Nature Genetics》論文看 Alpha 技術如何助力 DNA 甲基化修飾研究

表觀遺傳學 (Epigenetics) 是指可遺傳的、非基因序列改變所引起的基因表達的變化，包括基因體印記 (genomic imprinting)、基因沉默 (gene silencing)、核仁顯性 (nucleolar dominance)、跳躍子活化 (transposon activation) 和 RNA 編輯 (RNA editing) 等，主要調控機制包含：DNA 甲基化 (DNA methylation)、組蛋白修飾 (histone modification) 和非編碼 RNA (non-coding RNA)，是當前研究的熱點。

CpG 甲基化修飾對哺乳動物發育和維持組織恆定至關重要，在很多疾病中往往是失調的。DNA 甲基化 5mC 是由 DNA 甲基轉移酶 DNMT3A 和 DNMT3B 進行起始催化，過去曾有研究報導指出，DNMT3A 受其 PWWP 結構區域引導，會選擇性地定位到組蛋白 H3 第 36 位離胺酸二甲基化 (H3K36me2) 修飾區域，其次是 H3K36me3 修飾區域，但其具體的調控機制尚不清楚。

最近《Nature Genetics》雜誌上刊登了一篇關於 DNMT3A 調控的新機制：

研究者發現 DNMT3A 的 N 端區域與 Polycomb 抑制複合物 1 (Polycomb repressive complexe 1, PRC1) 催化的組蛋白 H2A 第 119 位離胺酸泛素化 (H2AK119ub) 修飾之間存在一種新的交互作用，並與之前報導的由 PWWP 區域引導定位至 H3K36me2 的交互作用，在招募 DNMT3A 上處於競爭關係。此新的研究發現顯示，DNMT3A 透過這兩種競爭募集機制調節 CpG 島 (CpG islands) 從頭甲基化 (de novo methylation) 的動態平衡。

首先，研究者在小鼠間葉幹細胞 (MSCs) 中建構了能夠穩定表達的野生型、PWWP 結構區域缺失和 PWWP 結構區域突變的 DNMT3A1 亞型，再透過染色質免疫沉澱-定序技術 (ChIP-seq) 比較它們在基因體圖譜上的分佈差異。結果發現，與野生型相比，PWWP 區域缺失或突變的 DNMT3A1 會更多地聚集在由 Polycomb 調控的 H2AK119ub 與 H3K27me3 修飾區域，且與 PRC1 介導生成的 H2AK119ub 修飾之間的共定位情形，會遠高於與 PRC2 催化生成的 H3K27me3 修飾。

接著，利用高靈敏度、均相免沖洗 AlphaLISA 技術進一步驗證 DNMT3A1 與不同修飾的核小體 (nucleosome) 間的結合能力。將 GST 標記的 DNMT3A1 與 Biotin 修飾的核小體置入 384-well 微量多孔盤孔洞中，再加入受體微珠 Glutathione AlphaLISA Acceptor Beads 和供體微珠 AlphaScreen Streptavidin Donor Beads，於室溫下靜置反應 60 分鐘後以 EnVision® 多功能微量盤檢測儀偵測 AlphaLISA 信號。

AlphaLISA 實驗結果顯示 DNMT3A1 與 H2AK119ub 修飾的核小體間存在強烈且專一性的結合能力，其與 H3K27me3 修飾的核小體則不存在。

使用 AlphaLISA 技術檢測 GST 標記的全長 DNMT3A1 (或 DNMT3B) 與不同修飾的核小體之間的交互作用。 © Nat Genet. 2021 Jun;53(6):794-800. Fig. 3a and 3c.

之後，研究者利用帶有 PWWP 結構區域突變 DNMT3A 的細胞，以 CRISPR/Cas9 技術剔除其 PRC1 (Ring1a/b) 基因，但保留 PRC2 (Ezh2)，發現剔除 PRC1 後即可破壞 PWWP 突變的 DNMT3A 與 CpG 島的結合，證明 DNMT3A 的確是透過與 PRC1 催化的 H2AK119ub 修飾交互作用，導致 CpG 島的高度甲基化 (hypermethylation)。

最終，研究者將 DNMT3A1 的 N 端結構區域替換在刪除了 PWWP 結構區域的 DNMT3B 上，發現能促使原本不具 H2AK119ub 修飾結合能力的 DNMT3B ΔPWWP 定位到 H2AK119ub 修飾區域，這顯示 DNMT3A1 和 H2AK119ub 修飾的交互作用是經由其 N 末端區域所主導的。

藉由在副神經節瘤 (paragangliomas) 和小頭侏儒症 (microcephalic dwarfism) 患者中發現的 PWWP 突變，研究者們得以證實 PWWP 結構區域突變後的 DNMT3A 會以 PRC1 依賴的方式促進 DNMT3A 異常定位至 CpG 島。釐清 DNMT3A 於 CpG 島從頭甲基化中所扮演的角色與調節機制，將可望引領我們更深入了解疾病與癌症機轉。

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