如果你的圖是像「圖A」這樣“黯淡無光”

ICC/IF 無訊號或訊號弱

可能原因

解決方案

目標蛋白質於樣本中不表現或表現量過低

• 查閱文獻，確認使用的細胞樣本是否有表現目標蛋白質，以及其表現量多寡
• 以 Western Blot 驗證目前使用的樣本的確有表現目標蛋白質，並確認其表現量
• 建議使用間接免疫螢光染色 (Indirect IF) 以放大訊號

目標蛋白質位於細胞內，抗體無法有效進入細胞反應

• 使用甲醇 (Methanol) 或丙酮 (Acetone) 作為固定液，可同時對細胞打洞
• 使用甲醛 (Formaldehyde) 或福馬林類固定液時，需額外以 0.1–0.25% Triton X-100 對細胞膜進行打洞處理；Triton X-100 含量百分比需進行測試與優化
• 適當延長細胞打洞處理時間

樣本固定方法不當，破壞目標蛋白質的抗原表位 (Epitope)

• 更換固定液，優化樣本固定時間

樣本儲存時間過長

• 使用新鮮製備的樣本，避免抗原被破壞

抗體無效或失效

• 選擇具有 ICC/IF 實驗驗證數據的抗體產品 [ICC/IF 實驗用一抗・ICC/IF 實驗用二抗]
• 設置陽性對照組 (例如過度表現目標蛋白質的細胞) 確認抗體效能
• 使用新鮮配製的抗體

抗體濃度過低

• 增加一抗/二抗的工作濃度，或透過序列稀釋測試抗體最佳工作濃度 [抗體稀釋指南]
• 建議於 4°C 避光孵育一級抗體一整晚

二級抗體無法辨識一級抗體

• 確認已正確選用與一級抗體相匹配的二級抗體，例如使用兔單株抗體作為一抗時，應選用抗兔子的二抗 [抗體選擇指南]

螢光訊號淬滅

• 螢光標定抗體需全程避光操作與孵育
• 選用含有螢光保護劑成分的封片膠
• 封片後立即進行影像觀察與拍攝

螢光顯微鏡濾片選擇不合適

• 確認所選濾片與使用的螢光染料相匹配

如果你的圖是像「圖B」這樣“一片閃亮”

ICC/IF 高背景值

可能原因

解決方案

自發性螢光

• 改用低自發螢光材質製造的器皿
• 設置未染色的樣本作為對照組，以確認樣本本身的自發螢光程度
• 細胞在藍色波長的自發螢光較高，應避免使用藍色螢光標定抗體檢測低豐度蛋白質
• 舊的甲醛溶液容易產生自發螢光，建議改用新鮮配製的甲醛固定液
• 固定後應充分洗滌樣本，避免固定液殘留
• 在阻斷液中添加終濃度為 0.3 mol/L 的 Glycine，或改用非醛類固定液

樣本變乾

• 在濕盒中孵育抗體，避免樣本乾燥

目標訊號過弱

• 改用更亮的螢光染料
• 實驗條件允許下，提高樣本中的目標蛋白質表現量，例如以藥物或特定條件誘導處理細胞，促使目標蛋白質表現量增加

阻斷不充分或未使用適合的阻斷液

• 適當延長阻斷時間
• 更換阻斷液，推薦使用二抗宿主血清作為阻斷液，例如二抗是 Goat Anti-Rabbit IgG 時，使用 Goat serum 作為阻斷液

抗體濃度過高

• 適當降低抗體濃度，或透過序列稀釋測試抗體最佳工作濃度 [抗體稀釋指南]

一級抗體非專一性結合

• 選擇具有 ICC/IF 實驗驗證數據的抗體產品 [ICC/IF 實驗用一抗]
• 使用與樣本不同物種來源的抗體，例如小鼠細胞樣本可選用兔單株抗體
• 設置陰性對照組確認抗體專一性，例如基因剔除細胞株 (Gene knockout cell lines) 或基因減弱細胞 (Gene knockdown cell)

二級抗體非專一性結合

• 設置不放一抗、只孵育二抗的對照組，以確認二抗專一性
• 改使用具有高度專一性的預吸附二級抗體

清洗不足

• 在 Wash buffer 中加入 Tween-20，並適當增加沖洗時間與次數

訊號光譜重疊 (多重染色)

• 調整顯微鏡設置，一次只接收一種螢光染料訊號
• 盡量選擇沒有光譜重疊的螢光染料