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使用 HTRF 技術篩選出瑞德西韋潛力協同用藥 老藥新用對抗新型冠狀病毒 (SARS-CoV-2) 截至目前為止，瑞德西韋 (Remdesivir) 仍是美國食品藥物管理局 (FDA) 唯一核准的 COVID-19 治療用藥 [1-3]。為了發掘更多潛在治療藥物，英國弗朗西斯・克里克研究中心 (Francis Crick Institute) Souradeep Basu 與 Tiffany Mak 等人試著從現有已知的小分子藥物中篩選找出能夠抑制新型冠狀病毒非結構蛋白質 “nsp14” 活性的候選藥物。 之所以選擇 nsp14 作為藥物標靶，一是因為它的序列穩定，不似棘蛋白 (Spike protein) 一般具有高突變率，二是因為它所具有的甲基轉移酶 (methyltransferase) 功能在病毒 RNA 5' 端加帽 (capping) 修飾過程中扮演著極為核心的角色（圖 1）。加帽修飾可以維持病毒 RNA 在宿主細胞內的穩定性與促進其轉譯為病毒蛋白質，同時還可將病毒 RNA 偽裝成宿主 RNA，避免引發宿主先天性免疫反應 (innate immune response)。因此若能抑制 nsp14 的甲基轉移酶活性，將可望降低病毒複製與感染效率，達到抗病毒效果 [4]。
圖 1﹑冠狀病毒 RNA 5' 端加帽 (capping) 修飾過程。首先，具有核糖核酸三磷酸水解酶 (RNA triphosphatase) 活性的 nsp13 會先移除掉新生成病毒 RNA 5' 端第一個核苷酸（通常是 ATP）的 γ-磷酸根 (γ-phosphate) 形成 ppA，接著透過 nsp12 的鳥苷酸轉移酶 (guanylyltransferase) 功能將 GMP 接上 RNA 5' 端 ppA，形成 RNA 5' 端帽核心結構 “GpppA”。nsp14 則具有鳥嘌呤-N7 甲基轉移酶 (guanine-N7 methyltransferase) 活性，可將原本位於 S-腺苷甲硫胺酸 (S-adenosyl-L-methionine, SAM, SAM) 的甲基轉移至 5' 端帽結構中鳥嘌呤的氮原子上，形成 “m7GpppA”，稱為 “帽 0 (cap-0)”。接著 nsp16/nsp10 複合物所具有的核糖 2'-O-甲基轉移酶 (2'-O-methyltransferase) 活性會進一步甲基化 5' 端帽中接於 GTP 後面的核苷酸，形成 “m7GpppAm”，稱為 “帽 1 (cap-1)” [4-7]。 IMAGE © Biochem J. 2021 Jul 16;478(13):2481-2497. Fig. 1B [4]. 使用 HTRF 技術進行高通量藥物篩選 (High Throughput Screening, HTS) 在製備完成 nsp14 純化蛋白與其反應受質 GpppA-RNA 等實驗材料後，Souradeep Basu 等人使用 Cisbio (part of Revvity) 所開發的檢測試劑【EPIgeneous™ Methyltransferase kit】來進行高通量藥物篩選。 EPIgeneous™ Methyltransferase kit 作用原理是基於 HTRF® 技術，並採用競爭型免疫分析法（圖 2）。簡單來說，反應中所使用到的兩個核心試劑 “SAH 抗體 (Anti-SAH antibody)” 以及 “SAH”，分別標定有供體螢光 Tb-Cryptate 與受體螢光 d2。當 SAH 抗體與 SAH 專一性結合後，供體螢光與受體螢光間的距離也隨之被拉近；在 337 nm 光源激發下，供體螢光所發出的能量 (620 nm) 即可轉移到鄰近的受體螢光，激發其產生 665 nm 螢光訊號。在 nsp14 甲基化 GpppA-RNA 的過程中，作為甲基來源的 S-腺苷甲硫胺酸 (S-adenosyl-L-methionine, SAM) 會轉變為 S-腺苷同半胱胺酸 (S-adenosyl-L-homocysteine, SAH)，此 SAH 產物會與 SAH-d2 競爭，造成 HTRF 訊號下降。
圖 2﹑EPIgeneous™ Methyltransferase kit 作用原理。 若待測藥物能夠抑制 nsp14 的甲基轉移酶活性，可觀察到 HTRF 訊號回升的現象（圖 3）。最終，可藉由 EC₅₀ 數值判斷藥物的抑制能力，篩選出候選藥物。
圖 3﹑以 HTRF 技術檢測 nsp14 甲基轉移酶活性。可以看到在加入 nsp14、GpppA-RNA 與 SAM 後，由於產生了 SAH 競爭物，因此導致 HTRF 訊號明顯下降。然而在加入廣泛型甲基轉移酶抑制劑 “Sinefungin” 後，可觀察到 HTRF 訊號回升，且回升幅度隨著 Sinefungin 使用劑量而增加。 IMAGE © Biochem J. 2021 Jul 16;478(13):2481-2497. Fig. 3B [4].
圖 4﹑EPIgeneous™ Methyltransferase kit 檢測流程。 透過 HTRF 檢測平台，Souradeep Basu 等人成功地從五千多種小分子藥物中，篩選找出四個候選藥物，分別是 PF-03882845、Inauhzin、Lomeguatrib 與 Trifluperidol（圖 5）。而為了進一步確認藥物的抑制專一性，他們還檢測了這四個候選藥物對 nsp16/nsp10 複合物的抑制能力。由於 nsp16/nsp10 複合物在甲基化 RNA 5' 端帽過程中同樣會產生 SAH 衍生物，因此他們一樣使用【EPIgeneous™ Methyltransferase kit】來檢測 nsp16/nsp10 複合物的甲基轉移酶活性。結果顯示這四種藥物對 nsp16/nsp10 複合物皆不具抑制能力，僅能專一性地抑制 nsp14 活性。
圖 5﹑英國弗朗西斯・克里克研究中心 Souradeep Basu 等人以 HTRF 檢測平台篩選找出四個能夠抑制新型冠狀病毒 nsp14 甲基轉移酶活性的候選藥物。從數據來看，PF-03882845 具有最佳的抑制能力。 IMAGE © Biochem J. 2021 Jul 16;478(13):2481-2497. Fig. 5B [4]. 瑞德西韋潛力協同用藥 在找出候選藥物後，Souradeep Basu 等人進一步使用新型冠狀病毒感染的非洲綠猴腎細胞 (Vero E6) 來驗證藥物在細胞中的抗病毒效果，以及是否能夠與瑞德西韋併用產生協同效應。實驗結果顯示，PF-03882845 (EC₅₀ = 10.97 μM)、Inauhzin (EC₅₀ = 12.96 μM)、Lomeguatrib (EC₅₀ = 59.84 μM) 與 Trifluperidol (EC₅₀ = 14.9 μM) 皆具有抗病毒效果，然而 Lomeguatrib 在其 EC₅₀ 濃度下會產生細胞毒性 (cytotoxicity)，其他三個藥物則沒有或僅有輕微的細胞毒性。 在合併使用瑞德西韋時，PF-03882845、Lomeguatrib 與 Trifluperidol 的 EC₅₀ 濃度都明顯下降，顯示這三種藥物皆能與瑞德西韋產生協同效應，其中以 PF-03882845 (EC₅₀+Remdesivir = 4.79 μM) 與 Trifluperidol (EC₅₀+Remdesivir = 5.05 μM) 表現最為出色（圖 6）！PF-03882845 是臨床二期的藥物，Trifluperidol 則是治療精神疾病（如思覺失調症 (schizophrenia)）的核准用藥，兩者皆有可能迅速發展為瑞德西韋協同用藥，將有待後續動物與臨床實驗證實 [4]。
圖 6﹑以新型冠狀病毒感染的非洲綠猴腎細胞，驗證四種候選藥物是否能夠與瑞德西韋產生協同效應。結果顯示與瑞德西韋併用成效最佳的兩個藥物為 PF-03882845 與 Trifluperidol。 IMAGE © Biochem J. 2021 Jul 16;478(13):2481-2497. Fig. 8C [4]. 完整可靠的藥物篩選解決方案 伯森生技提供完整可靠的藥物篩選解決方案——包含獲得阿斯特捷利康 (AstraZeneca)、默沙東 (Merck & Co., Inc)、輝瑞 (Pfizer) 等知名藥廠信賴採用的 ALPHA 與 HTRF 檢測試劑，以及小分子藥物庫、微量多孔盤、多功能盤式分析儀等——協助您建立高效穩定的高通量篩選平台，提升疫苗、生物製劑 (biologics)、細胞療法等生技醫藥領域的研發效率。完整產品資訊與技術支援服務，歡迎洽詢 Revvity, Enzo Life Sciences 台灣代理 — 伯森生技。
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