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更精確靈敏的 JAK 抑制藥物篩選工具
Janus 激酶 (Janus kinase, JAK) 是位於細胞內的一個非受體酪胺酸激酶 (nonreceptor tyrosine kinases) 家族，具有 JAK1、JAK2、JAK3 與 TYK2 四個家族成員，透過 JAK-STAT 訊息傳遞路徑參與細胞增生、分化、凋亡與免疫調節等重要機制，與多種自體免疫疾病、發炎性疾病、癌症和罕見免疫疾病相關 [1, 2]。 目前全球有九種核准上市的 JAK 抑制劑類小分子藥物 [3]，適應症包含類風濕性關節炎 (rheumatoid arthritis, RA)、乾癬性關節炎 (psoriatic arthritis, PsA)、潰瘍性結腸炎 (ulcerative colitis, UC)、骨髓增生性腫瘤 (myeloproliferative neoplasms, MPN)、急性移植物抗宿主疾病 (graft versus host disease, GVHD) 與異位性皮膚炎 (atopic dermatitis, AD) 等；其中原本用來治療類風濕性關節炎的藥物「Baricitinib」在 2020 年 11 月獲得美國食品藥物管理局 (FDA) 緊急使用授權 (EUA)，得與瑞德西韋 (Remdesivir) 合併使用於治療中至重症的 COVID-19 新冠肺炎患者 [3-5]。
圖中列出各細胞激素 (cytokines) 調控活化的 JAK，以及其對應的相關疾病與 JAK 抑制劑藥物（核准上市藥物列於小方框中的深色背景處，臨床試驗中藥物則列於淺色背景處）。 IMAGE © Eur J Immunol. 2021 Jul;51(7):1615-1627. Figure 1 [3]. 除了上述九種已上市 JAK 抑制劑藥物，還有許多 JAK、STAT 抑制藥物也已進入臨床試驗階段，其中又以 JAK 抑制劑類為大宗，應用範圍主要集中在自體免疫與發炎性疾病 [3]、癌症 [6] 和 COVID-19 [3, 4, 7] 。另一方面，已有多篇文獻指出源自天然蔬果的「植化素 (phytochemicals)」也能對 JAK-STAT 訊息傳遞路徑產生良好的調控效果，儘管多數研究成果仍處於細胞實驗階段，然而這仍揭示了植化素發展為治療藥物的可能性 [1, 8]。無論是小分子藥物型的 JAK 抑制劑或是天然植化素，在開發 JAK 抑制藥物過程中皆需要有良好的檢測工具，協助科研人獲得精確可靠的藥物篩選結果。以下就為您介紹 Cisbio (part of Revvity) 最新開發的 JAK 高效檢測試劑—— HTRF JAK Detection Kits。
HTRF JAK Detection Kits 採用 HTRF® 專利技術，此技術幾乎不具有任何技術門檻，只要會使用 Pipetman 就可以進行實驗！從產品效能來說，HTRF JAK Detection Kits 比 Western Blot 更加靈敏，且流程極為簡易，能夠讓您節省細胞與試劑用量、更快取得藥物篩選結果。
HTRF 檢測技術比 Western Blot 更加靈敏。以 Phospho-JAK2 為例，HTRF Human Phospho-JAK2 Tyr1007/1008 Detection Kit 的偵測靈敏度是 Western Blot 的八倍。 HTRF JAK Detection Kits 檢測原理類似三明治法。樣本中的 Total JAK（或磷酸化 JAK）會被兩支分別標定有供體螢光 Eu cryptate 和受體螢光 d2 的專一性抗體所辨識；隨著抗體與目標蛋白質的專一性結合，供體螢光與受體螢光間的距離將會被拉近並產生 HTRF 訊號，而訊號強度將會與目標蛋白質的表現量成正比。若待測藥物能夠抑制 JAK 的磷酸化，即可觀察到磷酸化 JAK 的 HTRF 訊號下降，藉由比較 IC₅₀ 數值即可判斷藥物的抑制能力，篩選出候選藥物。
HTRF JAK Detection Kits 檢測流程極為簡易。整個實驗以 96-well 或 384-well 微量多孔盤型式操作，首先以套組提供的 Lysis buffer 裂解經過藥物處理的細胞，釋放出細胞內的目標蛋白質；接著將兩支抗體與樣本（細胞溶解物或標準品）混合，於室溫下靜置反應 3 小時（或 1 晚）即可進行訊號偵測。極簡式流程設計可確保優質的實驗再現性與穩定度，最大程度減少實驗誤差。
產品效能實證 (一)﹑以 JAK2 抑制劑「CHZ868」驗證 HTRF JAK2 系列套組的檢測效能。不同濃度的 CHZ868 與人類紅血球性白血病細胞株 (HEL92.1.7) 混合培養 1 小時後，加入 Pervanadate 培養 30 分鐘，最後分別以 HTRF Human Phospho-JAK2 Tyr1007/1008 Detection Kit 與 HTRF Human Total JAK2 Detection Kit 檢測細胞內的磷酸化 JAK2 與 Total JAK2 蛋白質含量。如同預期的，隨著 CHZ868 濃度的增加，可測得的磷酸化 JAK2 也會隨之減少，然而 JAK2 蛋白質的整體表現量並不會受到 CHZ868 濃度所影響。
產品效能實證 (二)﹑以各種 JAK siRNA 測試 HTRF Phospho-JAK2 檢測套組的專一性。將人類紅血球性白血病細胞株 (HEL92.1.7) 分別與不同 JAK siRNA 或 Non-targeting Control siRNA 混合培養後，加入 Pervanadate 培養 30 分鐘，最後以 HTRF Human Phospho-JAK2 Tyr1007/1008 Detection Kit 進行檢測。結果顯示唯有在投予 JAK2 siRNA 的細胞可以偵測到蛋白質減少的現象，證實 HTRF Phospho-JAK2 檢測套組具有高專一性。
以下為您列出 HTRF JAK 系列檢測套組的產品訂購資訊。由於產品新增快速，歡迎洽詢伯森業務專員索取即時更新資訊。若您有興趣進一步了解 HTRF 技術與實驗操作細節，歡迎洽詢 Cisbio 台灣代理伯森生技。
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References
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