抗體簡介

圖源：Marks, Claire, and Charlotte M Deane. “How repertoire data are changing antibody science.” The Journal of biological chemistry vol. 295,29 (2020): 9823-9837. doi:10.1074/jbc.REV120.010181

抗體呈 Y 字型結構，由兩條相同的重鏈（Heavy chains）與輕鏈（Light chains）組成。結構上可分為負責結合抗原的 Fab 片段（手臂）與負責啟動免疫反應的 Fc 幹體（Stem）。

在分子層次，抗體由以下關鍵區域構成：

• 恆定區 (Constant domains, CH/CL)：序列高度保守。
• 可變區 (Variable domains, VH/VL)：序列差異大，兩者共同組成 Fv (Variable fragment)，決定抗原專一性。
• 互補決定區 (CDRs)：位於 Fv 上的三個序列差異度高的環 (Hypervariable loops)，是直接與抗原接觸的關鍵位點。

CDRs 的高度多樣性賦予抗體識別萬種抗原的能力，也是抗體工程 (Antibody Engineering) 的核心目標。透過改造 CDRs 的胺基酸序列，研究人員可開發針對新目標的單株抗體，廣泛應用於癌症與傳染病治療。

抗體開發有哪些步驟?

不論是透過 雜交瘤技術（Hybridoma technology） 篩選出高親和力的細胞株，或是經由噬菌體展示技術（Phage display）進行數輪淘選（Panning）所富集的純株，最終皆須進行抗體定序（Antibody sequencing），以確認其 CDRs 序列及框架區（Framework regions）是否發生非預期的突變。

雖然雜交瘤系統可直接對 RT-PCR 產物進行定序，但若要精確評估細胞株的單株純度（Clonal purity），或鑑定噬菌體所攜帶的抗體基因，標準作法仍須經由 E. coli transformation（大腸桿菌轉型） 進行克隆化，隨後抽提質體（Plasmids）以獲取高質量的 DNA 序列資訊。最終，這些海量的序列定序，皆需要高效率定序（High-throughput sequencing）來加速抗體研發的過程。

次世代定序 (NGS) 在治療性抗體開發的各個階段（從發現、工程設計到生產）都扮演著至關重要的角色。它能夠識別高親和力、高特異性的候選DNA片段，優化表現系統，並進行品質控制，以維持其遺傳完整性、一致性與安全性。抗體開發中的一個重要考量是確保單株性 (Clonality)，特別是在使用細菌表現系統時，co-transformation（圖 1）就會引入變異性。

圖1. 單個細菌在transformation的過程中，可以容納多個質體，當有突變點的質體也包含其中的時候，會嚴重影響下游應用的結果。

隨著定序技術的演進，若需要具備大規模檢測污染質體的能力，就需要高靈敏度結合高通量的解決方案。NGS 可以幫助解決單株性疑慮，在不造成抗體開發過程瓶頸的情況下，提供對序列準確性的信心。

由於抗體開發流程中 Synthetic construct 的使用規模龐大，定序靈敏度與通量都是關鍵考量因素。建庫（Library prep）方法的選擇會極大影響 NGS 數據生成的可靠性與整體通量，但這一點常被忽視。透過採用高性能及輕鬆同時操作大量樣本的建庫流程，NGS 能夠在確保序列準確性與抗體純度的基準下達到高通量及高靈敏度。

seqWell ExpressPlex™ 2.0 單步驟建庫方案 採用優化的新一代 transposase TnX ，可大幅度降低序列的偏差，並提高序列覆蓋的均勻性。其輕鬆的操作流程（圖2）適用於大量的 Plasmids 及 Amplicons 等 Synthetic construct 定序。

圖2. ExpressPlex 2.0 文庫預備套組利用專有的酶混合物，在單一反應中完成輸入 DNA 的接頭標記（Indexing）與文庫擴增。從質體或擴增子開始，僅需 100 分鐘（其中人工操作時間 30 分鐘）即可完成 96 甚至 384 個樣本的定序準備 (包含上機前 QC)。

ExpressPlex 2.0 展示了超高通量的擴展性，支持多達 6,144 個 Indexes、384 孔盤操作，在自動化設備的流程，只需要 2.5 小時，就能完成 1536 個樣本建庫。 相比之下，他牌 Tn5 轉位酶的工作流顯著更複雜，且對自動化不夠友善。處理 96 個樣本通常需要 3 到 6 小時（視產品而定）。這些差異代表了構建體篩選中的效率與通量限制。

ExpressPlex 2.0 套組將片段化、條碼標記和擴增整合在單一反應中，將人工操作時間縮短至 30 分鐘內。內置的自動校正（Auto-normalization) 功能讓使用者無需手動調整樣本的輸入或輸出濃度。該工作流生成的每個樣本定序讀取數（Read counts）分佈非常集中 （圖3），極大地減輕了高多工定序前的 QC 負擔。

圖3. ExpressPlex 2.0（藍色）在 120 個樣本中實現了更一致的讀取數（變異係數 C.V. 為 12.1%），而他牌（橘色）在相同樣本量下的 C.V. 為 44.8%

在使用細菌宿主的工作流中，單株性問題尤為突出，因為多個質體的 co-transformation 是可能會發生，導致污染。

為了模擬質體共轉化，seqWell 設計了一組 5 個具有單鹼基突變（包括插入、缺失和替換）的質體（圖4）。

圖4. 設計具有單鹼基突變的質體，包括：A 變 C、A 變 G、A 變 T、單鹼基缺失及單鹼基插入。

接著，研究人員將攜帶單鹼基突變的質體以 8 個不同比例摻入（Spike-in）背景控制質體中：0%（對照組）、0.1%、0.2%、0.4%、0.5%、1%、10% 和 20%，以評估 ExpressPlex 2.0 檢測共轉化的能力。

實驗同時使用他牌的 Tn5 套組處理相同樣本，並在 Illumina NextSeq 2000 上進行定序。行業公認的靈敏度標準設定為 0.5% 的共轉化變異量。即使在低於 1% 的低比例摻入情況下，ExpressPlex 2.0 也能準確追蹤預期的變異百分比（圖5）。

圖 5. 準確量化低於 1% 的污染質體，證明了 ExpressPlex 2.0 在質體純度品質控制方面的強大能力。