伯森生技電子報 20209月號第5 無法看到畫面顯示?請點選這裡開啟網頁
全方位檢測病毒生命週期各階段的蛋白質交互作用

全方位檢測病毒生命週期各階段的蛋白質交互作用

蛋白質交互作用 (Protein-protein interaction, PPI) 在病毒生命週期的每個階段(包含:附著、進入、脫殼、核酸複製、顆粒組裝與釋放等)皆佔有舉足輕重的地位,因此非常適合作為病毒治療藥物的研究標靶。以下我們就透過流感病毒 (Influenza virus)鼠肝炎冠狀病毒 (Mouse hepatitis coronavirus, MHV)愛滋病毒 (HIV)近期研究成果,闡述 Alpha 及 HTRF 技術如何幫助科研人員進行病毒生命週期各個階段的蛋白質交互作用檢測與靶向藥物篩選。

Generic viral life cycle diagram highlighting some of the protein-protein interactions that could be used as targets for antiviral therapies.

Generic viral life cycle diagram highlighting some of the protein-protein interactions that could be used as targets for antiviral therapies.

病毒治療藥物開發強勢助力:Alpha 與 HTRF生物分子檢測平台

AlphaHTRF 是由 PerkinElmerCisbio (part of PerkinElmer) 公司所開發的全均質化 (Homogeneous) 生物分子檢測技術,能夠測定解離常數 (KD) 範圍從皮莫爾 (pM) 至毫莫爾 (mM) 的各種親和性交互作用;且由於實驗過程中完全不需沖洗步驟,因此即使是短暫的交互作用 (Transient interactions) 亦可偵測得到!Alpha 與 HTRF 技術運用在蛋白質交互作用的偵測原理與實驗設計,將在下方的整理報導中進一步說明。

流感病毒小分子藥物篩選

病毒學中最常被研究的蛋白質交互作用之一,就是病毒蛋白質與宿主細胞受體 (Receptor) 之間的交互作用。阻止病毒進入細胞是抵抗病毒感染最有效的途徑之一,免疫系統即利用抗體來阻斷病毒進入細胞 [1]。近幾年已開發出流感病毒的通用型中和抗體 (Broadly neutralizing antibodies, bnAbs),該抗體可藉由與流感病毒表面醣蛋白血球凝集素 (Hemagglutinin, HA) 的結合,阻斷病毒進入細胞。為降低藥物成本與增進使用便利性,van Dongen 研究團隊投入找尋能夠取代通用型中和抗體的口服式小分子藥物。他們採用 AlphaLISA 檢測平台來進行藥物篩選,再經由結構優化與多方面測試,成功開發出具有與通用型中和抗體類似阻斷效果的先導藥物 JNJ4796 [2]。

AlphaLISA competition assay

van Dongen 研究團隊所設計的 AlphaLISA 檢測平台藥物篩選原理,是將 HA 蛋白與中和抗體類似物 Nab Mimic 進行標定(以 Biotin 標定 HA 蛋白﹑6xHis-tag 標定 Nab Mimic),使其分別能被標定有 Streptavidin 的 Alpha 供體微珠 (Donor bead) 與標定有 His-tag 抗體的受體微珠 (Acceptor bead) 所捕獲。當 HA 蛋白與 Nab Mimic 產生交互作用時,供體微珠與受體微珠也隨之被拉近,在 680 nm 雷射光激發下,供體微珠所產生的能量即可促使鄰近的受體微珠產生 615 nm 訊號。若待測藥物與中和抗體能結合於相同的表位 (HA epitope),就會與 Nab Mimic 產生競爭,造成 Alpha 訊號下降。最終可藉由 IC₅₀ 數值判斷藥物的抑制能力,篩選出候選藥物進行後續確效試驗 [2]。

鼠肝炎冠狀病毒 S 蛋白與宿主受體蛋白質交互作用檢測

Shang 研究團隊則是利用 AlphaScreen 檢測平台來分析鼠肝炎冠狀病毒的 S 蛋白 (Spike protein) 與宿主細胞受體 CEACAM1a 之間的交互作用,結果顯示 S 蛋白亞單元 S1 的 N 端結構區域(以下簡稱 S1-NTD)以及 S 蛋白胞外結構區域 (Ectodomain)(以下簡稱 S-e),兩者對於受體蛋白 CEACAM1a 的結合親和性幾乎沒有區別,顯示鼠肝炎冠狀病毒的 S1-NTD 結構區域已隨時準備好識別並作用於受體 [3]。

AlphaScreen protein-protein binding assay

在此篇論文中,病毒蛋白與宿主受體之間交互作用的 AlphaScreen 檢測原理,是將病毒蛋白(S1-NTD 或 S-e)以 His-tag 標定,使其能被標定有 Nickel chelate 的 Alpha 供體微珠捕獲;宿主受體蛋白 CEACAM1a 則是以 Fc-tag 標定,使其能被標定有 Protein A 的 Alpha 受體微珠捕獲;當待測病毒蛋白與受體蛋白結合時,供體微珠與受體微珠也隨之被拉近,進而產生 Alpha 訊號 [3]。

愛滋病毒小分子藥物篩選

而在愛滋病毒的部分,目前已知衣殼蛋白 (Capsid, CA) 在 HIV-1 病毒脫殼、轉錄複製、組裝等多方面皆扮演著重要的角色,是很好的治療或疫苗研究對象。Zhang 研究團隊就利用 HTRF 技術建立了靶向衣殼蛋白的小分子抑制藥物篩選平台,並找尋到一個具有抑制病毒複製與衣殼蛋白組裝功效的候選藥物 TX-1918 [4]。

HTRF-based CAI binding competition assay

在此篇論文中,作者所建立的 HTRF 藥物篩選平台其偵測原理如下:以 Biotin 標定已知的衣殼蛋白胜肽抑制劑 CAI 、以 GST 標定衣殼蛋白 C 端結構區域 CA-CTD(該區域能與 CAI 抑制劑結合作用),使兩者分別能被標定有 XL665 受體螢光的 Streptavidin 與標定有 Europium cryptate 供體螢光的 GST 抗體所捕獲。當 CA-CTD 與 CAI 結合時,供體螢光與受體螢光之間的距離即被拉近,於 320 nm 光源激發下,供體螢光所發出的能量(620 nm)即可轉移至鄰近的受體螢光,激發其產生 665 nm 的螢光訊號。若待測藥物具有與 CA-CTD 結合的能力,就會與 CAI 產生競爭,造成 HTRF 訊號下降。藉由 IC₅₀ 數值即可判斷藥物的抑制效果,找出候選藥物 [4]。

尚有諸多 Alpha 及 HTRF 技術應用於病毒複製病毒逃避宿主免疫機制病毒組裝成熟的近期研究整理報導,詳情請見專文〈Utilizing Homogeneous Protein-Protein Interaction Assays for Virology Research〉。完整產品資訊與技術支援,歡迎洽詢 PerkinElmer 台灣代理 — 伯森生技。

References

  1. Klimpel GR. Immune Defenses. In: Baron S, ed. Medical Microbiology. 4th ed. Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996. Chapter 50. PMID: 21413332
  2. van Dongen MJP, Kadam RU, Juraszek J, et al. A small-molecule fusion inhibitor of influenza virus is orally active in mice. Science. 2019;363(6431):eaar6221. PMID: 30846569
  3. Shang J, Wan Y, Liu C, et al. Structure of mouse coronavirus spike protein complexed with receptor reveals mechanism for viral entry. PLoS Pathog. 2020;16(3):e1008392. Published 2020 Mar 9. PMID: 32150576
  4. Zhang DW, Luo RH, Xu L, et al. A HTRF based competitive binding assay for screening specific inhibitors of HIV-1 capsid assembly targeting the C-Terminal domain of capsid. Antiviral Res. 2019;169:104544. PMID: 31254557
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