抗​病毒藥物篩選與疫苗研發新助力 — 病毒 dsRNA HTRF 定量檢測平台 | PerkinElmer Cisbio

抗​病毒藥物篩選與疫苗研發新助力 — 病毒 dsRNA HTRF 定量檢測平台

有沒有什麼方法可以加快抗病毒藥物開發流程? 以核糖核酸 (RNA) 作為遺傳物質的 RNA 病毒是多種人類嚴重傳染病的病原體,例如造成 COVID-19 全球大流行的新型冠狀病毒 (SARS-CoV-2) 就是一種帶有正向單股 (positive-sense single-stranded) RNA 的病毒,其他諸如流感病毒 (Influenza virus)、腸病毒 (Enterovirus)、愛滋病毒 (HIV)、登革熱病毒 (Dengue virus) 與伊波拉病毒 (Ebola virus) 等,也都是屬於 RNA 病毒的行列 [1, 2]。

目前許多 RNA 病毒和 SARS-CoV-2 一樣都缺乏有效治療藥物與疫苗。為了加快抗病毒藥物篩選流程,日本杏林製藥株式會社 (KYORIN Pharmaceutical Co., Ltd.) 研發團隊提倡以病毒雙股 RNA (以下簡稱 dsRNA) HTRF 定量檢測方法取代傳統溶斑試驗 (Plaque assay)、細胞病變試驗 (cytopathic effect (CPE) assay) 與即時定量聚合酵素鏈鎖反應 (qPCR)。藉由簡化實驗流程(甚至使流程自動化)來縮短篩藥時間、降低實驗成本,進而提高抗病毒藥物的開發效率 [3]。以下我們就來看看病毒 dsRNA HTRF 定量檢測是怎麼做的?以及和 CPE assay、qPCR 比較起來,結果是否可信?

RNA 病毒複製過程

圖 1﹑RNA 病毒複製過程。圖 A 為正向單股 RNA 病毒 ((+)ssRNA viruses),圖 B 則是雙股 RNA 病毒 (dsRNA viruses) 與負向單股 RNA 病毒 ((-)ssRNA viruses) 。 IMAGE © Biotechnol Adv. 2018 May-Jun;36(3):557-576. Fig. 2A, 2B [2].

病毒 dsRNA HTRF 定量檢測原理與流程 在談論作用原理之前,我們可以先從圖 1 中了解到,無論是單股或是雙股 RNA 病毒,在感染細胞後,都會在細胞內複製產生出病毒 dsRNA [2]。因此可以藉由偵測加藥後細胞內病毒 dsRNA 的含量變化,篩選出具有抑制 RNA 病毒增生活性的抗病毒藥物!日本杏林製藥株式會社 Michiaki Nagasawa 所率領的團隊就使用 PerkinElmer Cisbio 公司所開發的【Viral double-stranded RNA detection kit (Cat# 64RNAPEG)】來進行病毒 dsRNA 的定量檢測。該產品採用 HTRF® 專利技術,具有流程簡易、高效穩定等特性 [3]。

Viral double-stranded RNA detection kit 檢測原理類似三明治法(圖 2)。細胞溶解物 (cell lysates) 中的病毒 dsRNA 會被兩支 dsRNA 專一性抗體所辨識,這兩支抗體分別標定有供體螢光 Eu cryptate 和受體螢光 d2。隨著抗體與病毒 dsRNA 的結合,供體螢光與受體螢光得以靠近,在 317 nm 光源激發下,供體螢光所發出的能量 (620 nm) 將可轉移到鄰近的受體螢光,激發其產生 665 nm 螢光訊號,訊號強度與病毒 dsRNA 含量成正比。若待測藥物具有抑制 RNA 病毒複製的活性,可觀察到 HTRF 訊號下降,藉由 EC₅₀ 數值即可判斷藥物的抗病毒效能,篩選出候選藥物。

Viral double-stranded RNA detection kit (Cat# 64RNAPEG) 檢測原理

圖 2﹑Viral double-stranded RNA detection kit (Cat# 64RNAPEG) 檢測原理。
IMAGE © PerkinElmer Cisbio

Viral double-stranded RNA detection kit 檢測流程極為簡易(圖 3)。首先以套組提供的 Lysis buffer 裂解病毒感染細胞,取得細胞溶解物。接著將兩支抗體與樣本(標準品或細胞溶解物)混合,於 4°C 下靜置反應一晚,即可進行訊號偵測。Viral double-stranded RNA detection kit 的極簡式流程設計,可將實驗操作變異因素降至最低,體現出優越的偵測穩定度與實驗再現性!dsRNA 濃度檢測範圍為 1.56-100 ng/ml。

Viral double-stranded RNA detection kit (Cat# 64RNAPEG) 檢測流程

圖 3﹑Viral double-stranded RNA detection kit (Cat# 64RNAPEG) 檢測流程。
IMAGE © PerkinElmer Cisbio

病毒 dsRNA HTRF 定量檢測法與 CPE assay、qPCR 的比較 Michiaki Nagasawa 團隊首先以多種正向單股 RNA 病毒感染細胞來驗證病毒 dsRNA HTRF 定量檢測法的有效性,測試樣本包含人類鼻病毒 (HRV-B14) 感染 H1-HeLa 細胞﹑腸病毒 (EV-A71) 感染 RD 細胞﹑腸病毒 (EV-D68) 感染 H1-HeLa 細胞﹑克沙奇病毒 (CV-A21) 感染 H1-HeLa 細胞﹑克沙奇病毒 (CV-B3) 感染 Vero 細胞﹑小鼠諾羅病毒 (MNV-S7) 感染 RAW 264.7 細胞等,結果發現病毒 dsRNA HTRF 定量檢測法的確可以精確地偵測到隨著病毒感染劑量 (multiplicity of infection, MOI) 增加而提高的細胞內病毒 dsRNA 濃度變化;同時也藉由 RNase III,驗證了病毒 dsRNA HTRF 定量檢測法的專一性。

接著,Michiaki Nagasawa 團隊使用能夠抑制人類鼻病毒增生的藥物 “Rupintrivir (AG7088)” 來測試比較病毒 dsRNA HTRF 定量檢測法、CPE assay 與 qPCR,結果顯示這三種方法所測得的 EC₅₀ 濃度極為相近(圖 4),進一步驗證了病毒 dsRNA HTRF 定量檢測結果的可靠性 [3]!Michiaki Nagasawa 團隊的研究成果證實病毒 dsRNA HTRF 定量檢測法能夠以極簡易的流程提供與 CPE assay、qPCR 比肩的精確結果。特別值得一提的是,與 qPCR 相比,病毒 dsRNA HTRF 定量檢測法既不需要核酸萃取步驟,也不需要依據 RNA 病毒種類設計使用不同的專一性引子或探針,能在實驗便利度與經濟成本上,為原本的 qPCR 使用者帶來明顯的改善與助益;而與 Plaque assay 相比,病毒 dsRNA HTRF 定量檢測法除了能夠大幅縮短檢測時間,還可避免因繁複流程與人工判讀結果導致的數據偏差,讓實驗結果變得更加精準穩定。

圖 4﹑使用病毒 dsRNA HTRF 定量檢測法、CPE assay 與 qPCR assay 所測得的 Rupintrivir 藥物 EC₅₀ 濃度極為相近。以 HRV-B14 病毒感染 H1-HeLa 細胞 1 小時後,對細胞投予不同劑量的 Rupintrivir 進行培養,接著分別使用病毒 dsRNA HTRF 定量檢測法、CPE assay 與 qPCR 檢測 Rupintrivir 的抑制活性。 IMAGE © Anal Biochem. 2019 Feb 1;566:46-49. Fig. 2C, Supplementary Fig. 6B and 6A [3].

完整可靠的 dsRNA 定量檢測解決方案 病毒 dsRNA HTRF 定量檢測法不僅可以用來作為抗 RNA 病毒藥物的高通量篩選平台,還可應用於疫苗、重組蛋白、細胞療法等生物製劑 (biologics) 的品質確校監測。特別是對 mRNA 疫苗與 mRNA 治療藥物而言,在製程中所產生的 dsRNA 副產物不僅會降低疫苗與藥物的效力,還會引發不良的免疫反應,因此確保產物中無 dsRNA 不純物的存在,是 mRNA 生物製劑品質管控中極為重要的一環 [4-7]。PerkinElmer Cisbio 公司所開發的病毒 dsRNA HTRF 定量檢測解決方案——涵蓋偵測套組微量多孔盤多功能盤式分析儀——能以優異穩健的效能協助您更快完成病毒等來源 dsRNA 的定量檢測。

病毒 dsRNA HTRF 定量檢測解決方案 | PerkinElmer Cisbio

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References

  1. Li Y, et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Apr 20;118(16):e2022643118. PMID: 33811184
  2. Rumlová M, Ruml T. In vitro methods for testing antiviral drugs. Biotechnol Adv. 2018 May-Jun;36(3):557-576. PMID: 29292156
  3. Fujita M, Adachi K, Nagasawa M. Development of a homogeneous time-resolved fluorescence assay for detection of viral double-stranded RNA. Anal Biochem. 2019 Feb 1;566:46-49. PMID: 30352199
  4. Frederickson R, Herzog RW. RNA-based vaccines and innate immune activation: Not too hot and not too cold. Mol Ther. 2021 Apr 7;29(4):1365-1366. PMID: 33705707
  5. Zhang C, et al. Advances in mRNA Vaccines for Infectious Diseases. Front Immunol. 2019 Mar 27;10:594. PMID: 30972078
  6. Pardi N, et al. mRNA vaccines - a new era in vaccinology. Nat Rev Drug Discov. 2018 Apr;17(4):261-279. PMID: 29326426
  7. Nelson J, et al. Impact of mRNA chemistry and manufacturing process on innate immune activation. Sci Adv. 2020 Jun 24;6(26):eaaz6893. PMID: 32637598
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