上海科技大學楊海濤教授與清華大學饒子和教授合作團隊同樣希望藉由藥物重新定位,從舊藥中篩選找出可能的 SARS-CoV-2 抗病毒治療藥物。他們所選擇的藥物標靶是 SARS-CoV-2 主蛋白酶 (main protease, Mpro)。Mpro 會在 SARS-CoV-2 進入細胞後表現,主要功能是用來切割 SARS-CoV-2 複製酶 (replicase) 基因所表現出的兩條長片段多聚蛋白 "pp1a" 與 "pp1ab",使其形成多個功能蛋白質執行病毒核酸複製與轉錄工作。由於 Mpro 在病毒生命週期中擔負著極為關鍵的角色,且在人體內並無相似分子,因此是非常好的抗病毒藥物設計標靶。
根據饒子和研究團隊在 2005 年的研究成果,他們發現不同冠狀病毒的 Mpro 雖然序列相似度不高,但是在 Mpro 受質結合區域 (substrate-binding pocket) 卻存在著高度保留的立體結構。因此楊海濤與饒子和合作團隊首先想到的就是當時所找出的通用於多種冠狀病毒的 Mpro 抑制化合物 "N3" 是否也同樣適用於 SARS-CoV-2 Mpro?根據 SARS-CoV-2 Mpro 與 N3 複合體的晶體結構解析結果,他們發現 N3 的確可以穩定地嵌合在 SARS-CoV-2 Mpro 的受質結合區域內。

圖 2﹑ SARS-CoV-2 Mpro 與 N3 複合體的晶體結構。N3(綠色)嵌合於 SARS-CoV-2 Mpro 的受質結合區域內。藍色代表 SARS-CoV-2 Mpro 的 A 單元體 (Protomer A),鮭魚粉代表 SARS-CoV-2 Mpro 的 B 單元體 (Protomer B)。 IMAGE © Nature. 2020 Jun;582(7811):289-293. Fig. 1b [2].
接著他們進一步將此複合體結構資訊應用於電腦虛擬篩選,找出一個同樣能緊密嵌合於 SARS-CoV-2 Mpro 受質結合區域的化合物 "Cinanserin"。同時他們也利用酵素活性分析試驗高通量篩選 10,000 個現有的臨床/臨床前期測試藥物與天然產物。酵素活性分析試驗作用原理是利用一段可被 SARS-CoV-2 Mpro 辨識切割的胜肽作為反應受質,該胜肽同時含有螢光分子 Mca 以及熄光分子 (quencher) Dnp。當該胜肽被 SARS-CoV-2 Mpro 切割水解後,即可在 320 nm 激發下發射出 405 nm 螢光訊號。若待測藥物能夠抑制 SARS-CoV-2 Mpro,就會造成螢光訊號下降。作者使用 EnVision® 多功能微量盤檢測儀進行螢光訊號檢測,最終篩選出 6 個具有抑制活性的藥物,其中 "Ebselen" 表現最佳。後續的細胞實驗也證實 Ebselen 具有比 N3 與 Cinanserin 更佳的抗病毒效果,同時根據動物實驗與人類臨床測試紀錄,Ebselen 是個毒性極低的安全藥物,顯示 Ebselen 具有發展為 SARS-CoV-2 治療藥物的強大潛力。此重大發現已於 2020 年 4 月線上發表於《Nature》期刊 [2]。

圖 3﹑以酵素活性分析試驗自 10,000 個舊有藥物中篩選出 6 個具有抑制 SARS-CoV-2 Mpro 活性的藥物,其中 "Ebselen" 表現最佳,IC₅₀ 數值為 0.67 μM。 IMAGE © Nature. 2020 Jun;582(7811):289-293. Fig. 3 [2].
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